導入
アガロースゲル電気泳動は、おそらく研究室で最初に行う実験の一つでしょう。今日は、この重要な技術について、その基本原理から実践的なヒント、そしてトラブルシューティング戦略まで、詳しく見ていきましょう。
I. 原則セクション
1)アガロースゲル電気泳動の原理は何ですか?
アガロースゲル電気泳動は、アガロースを支持マトリックスとして使用する方法であり、DNA 断片の回収、サイズ分離、および組み換え DNA またはプラスミド消化の検証に広く使用されています。
仕組み：アガロースは多孔質のネットワーク構造を形成し、DNAが通過する際に抵抗を生じます。DNA断片はサイズと電荷が異なるため、電界下では負極から正極へと異なる速度で移動し、サイズに基づいた分離が可能になります。
II. 実技セクション
1) 適切なアガロース濃度を選択するにはどうすればよいでしょうか?
回答：使用する核酸断片のサイズに応じて選択してください。調製のガイドラインについては、標準濃度チャートを参照してください。
2) 核酸染色の選択方法は？
回答: 市販されている一般的な核酸染色には、 EB 、 GoldView 、 GelRed/GelGreenなどがあります。
- EB（エチジウムブロマイド）： DNA塩基対間に挿入され、300 nmと360 nmで紫外線吸収のピークを示し、590 nmで橙赤色の蛍光を発します。高感度と低コストという利点がありますが、変異原性があり、人体に対して毒性があります。
- GoldView：アクリジンオレンジを主成分とし、DNAとRNAの両方を染色し、異なる蛍光色を発します。励起ピークは492 nm、蛍光ピークは530 nm（DNA）と640 nm（RNA）です。大きな断片には有効ですが、小さな断片（<500 bp）には適していません。蛍光は紫外線下で急速に減衰するため、ゲル回収には適していません。
-
GelRed/GelGreen:細胞膜を貫通しないため、より安全な代替品です。
- GelRed は赤色蛍光を発します (EB と同様)。
- GelGreen は緑色の蛍光を発します (SYBR® Green または SYBR® Safe と同様)。
- どちらも UV 対応で、GelGreen は青色光透過照明器にも適しています。
3) ゲル電気泳動を成功させるための重要なヒント:
- ゲルフラスコを過剰に満たさないでください。加熱中に溢れるのを防ぐため、容量は 50% 未満に保ってください。
- 加熱中はアガロースが完全に溶けていることを確認してください。蒸発を抑えるため、密封フィルム（気密ではないもの）で覆ってください。
- 泡を避けるために熱すぎない適切な温度でジェルを注ぎます。
- 染料の追加:染料をジェルにあらかじめ混ぜておく (便利) ことも、浸漬法を使用して後で染料を加えることもできます。
III. トラブルシューティングセクション
1) バンドがうまく分離されていませんか?
考えられる原因:
- 電気泳動時間が短すぎます。泳動時間を長くしてみてください。
- ゲル濃度が正しくありません。計量または蒸発のエラーがないか確認してください。
- サンプル内の塩分濃度が高いと、移動度に影響する可能性があります。
2) 電気泳動後にバンドが見えませんか？
2つのシナリオ:
-
マーカーにもサンプルにもバンドは表示されません。
- 染料は添加も分解もされていない
- 電気泳動パラメータが正しくない
-
マーカーにはバンドが表示されますが、サンプルには表示されません。
- PCRで標的を増幅できませんでした - PCR条件を最適化してください
- 読み込みバッファが正しく追加されていません
- 核酸抽出に失敗したか、濃度が低すぎます
3) バンドを笑顔にするか、それとも汚れを塗るか?
ゲル、染色、サンプル、または電気泳動条件に問題がある可能性があります。
- ジェル関連:
アガロースの溶融が不完全であったり、ゲルの硬化時間が不十分であったりすると、細孔サイズが不均一になり、移動も不均一になります。
-
汚れ関連:
- 染色中の高温は染料構造を損傷する可能性があります。ゲルが40～50℃まで冷えてから染色してください。
- 汚れの分布が不均一だと移行に差が生じます。
- 解決策: 染料を追加した後、よく混ぜるか、染色後の方法を使用します。
-
サンプル関連:
- スマイルバンド：オーバーロード（通常500 ng以上）により発生します。PCR、酵素消化、マーカーの場合は3～5 µLで十分です。
- スメアリング（テーリング）：分解による可能性があります。サンプルは手袋とRNase/DNaseフリーの器具を使用して取り扱ってください。特にRNAの場合は重要です。
-
電気泳動関連:
- 高電圧（150V以上）はにじみの原因となる場合があります。推奨電圧：110～130V。
- また、ランニングバッファーのpH とイオン強度も確認してください。常に新しく調製したバッファーを使用してください。
4) サンプルがウェルに詰まっていませんか?
考えられる原因:
- サンプル中のタンパク質または細胞破片がDNA/RNAと架橋されている
- 過負荷
- 電圧またはバッファ構成が正しくありません
5) かすかな帯？
-
大きな断片のバンドが薄くなる:大きな DNA 断片は染色にあまり効率的に結合しません。
解決策:染料を追加し、充填量を減らします。 -
小さな断片のバンドが薄い：染色の移行の影響を受ける可能性があります。
解決策:後染色法の使用を検討してください。
関連製品の選択に関するガイドライン
従来のPCR |
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| 仕様 | 10167ES | 10102ES | 10103ES | 10108ES |
| 増幅長 | ≤10 -15 キロバイト | ≤5 kb | ≤5 kb | ≤4 kb |
| 延長時間 | 1～10秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb |
| 製品エンド構造 | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA |
| アニール温度 | 60℃ | 温度-(2~5)℃ | 温度-(2~5)℃ | 温度-(2~5)℃ |
| GC互換性範囲 | 30～70% | 40～70% | 40～70% | 30～70% |
| 5'-3'エキソヌクレアーゼ活性 | 現在 | 現在 | 現在 | 現在 |
| コロニーPCR | 適切な | 適切な | 適切な | 適切な |
| 遺伝子同定 | 適切な | 適切な | 適切な | 適切な |
| マルチプレックスPCR | 不適切 | 不適切 | 不適切 | 3-4プレックスPCR |
| 電気泳動指示薬 | 紫赤 | 青 | 無色 | 青 |
| ホットスタート | ホットスタート | ホットスタートではない | ホットスタートではない | ホットスタート |
| プレミックス/キット | プレミックス | プレミックス | プレミックス | プレミックス |
直接PCR |
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| 仕様 | 10185ES | 10188ES | 10187ES | |
| 製品タイプ | マウス直接増幅 | 血液直接増幅 | 植物直接増幅 | |
| 増幅長 | ≤1 kb | ≤8 kb | ≤1 kb | |
| 延長時間 | 30秒/kb | ≤2 kbの場合は3-5 s/kb、 | 60秒/kb | |
| ≤8 kbの場合10 s/kb | ||||
| サンプル溶解時間 | 15分 | 0～3分 | 0～10分 | |
| 製品エンド構造 | ブラントエンド | ブラントエンド | ブラントエンド | |
| アニール温度 | Tm-(2~5) ℃ | Tm-(1~2) ℃ | Tm-(2~5) ℃ | |
| GC互換性範囲 | 30～70% | 30～75% | 40～65% | |
| 5'-3'エキソヌクレアーゼ活性 | √ | √ | √ | |
| 遺伝子同定 | √ | √ | √ | |
| マルチプレックスPCR | 3-4プレックス | |||
| 直接サンプル増幅 | √ | √ | √ | |
| 電気泳動指示薬 | 青 | 無色 | 青 | |
| ホットスタート | √ | √ | √ | |
| プレミックス/キット | キット（ミックス付き） | キット（ミックス＋バッファー付き） | キット（ミックス付き） | |
| 適切な生物 | マウス、ラット | 人間、ネズミ、ヤギ、ニワトリ、ブタなど。 | 米、トウモロコシ、タバコ、菜種、小麦、大豆など | |
| 適切な組織/材料 | 尾、耳、足指（筋肉付き）、その他の臓器 | EDTA、ヘパリン、クエン酸などを添加した新鮮血、冷蔵（冷凍）血、市販の乾燥血痕 | 若い葉、古い葉、苗、若い茎 | |
| サンプル入力 | 組織：5～10 mg；尾：1～5 mm | 全血：0.5％～20％、 乾燥血液斑点：1 mm² | 葉：1～10 mm、種子：1～3 mm | |
高忠実度PCR |
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| 仕様 | 10164ES | 10153ES | 10154ES | |
| 増幅長 | ≤10 kb gDNA、≤10 kb cDNA、≤16 kb λDNA | ≤10 kb gDNA、≤10 kb cDNA、≤13 kb λDNA | ≤10 kb gDNA、≤10 kb cDNA、≤13 kb λDNA | |
| 延長時間 | 5秒/kb | 30秒/kb | 30秒/kb | |
| フィデリティ（Taq） | 83× | 83× | 83× | |
| 製品エンド構造 | ブラントエンド | ブラントエンド | ブラントエンド | |
| アニール温度 | 60 ℃ | 68 ℃ | 68 ℃ | |
| GC互換性範囲 | 20～80% | 30～60% | 30～60% | |
| 5'-3'エキソヌクレアーゼ活性 | 不在 | 不在 | 不在 | |
| 電気泳動指示薬 | 青 | 無色 | 青 | |
| 単一酵素/プレミックス | プレミックス | 単一酵素 | プレミックス | |
| 許容範囲 | / | / | 血液、マウス組織溶解物 | |
核酸電気泳動 |
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| 製品カテゴリー | 猫NO. | 製品名 | 応用 | |
| アガロース | 10208ES | アガロース | 通常の核酸電気泳動 | |
| 10221ES | 高ふるいアガロース（PCRグレード） | 20bp～800bpのDNA断片の分離に適しており、ポリアクリルアミドゲルに匹敵します。 | ||
| 10226ES | アガロース錠（0.5g/錠） | 日常的なアガロースアプリケーションに便利 | ||
| 核酸色素 | 10202ES | YeaRed核酸ゲル染色液（水中10,000倍） | 水溶性で、EBと同様のスペクトル特性を持ち、300 nmのUV光で励起可能 | |
| DNAマーカー | 10510ES | ゴールドバンド 1 kb DNAラダー | 250～12000 bp（13バンド） | |
| 10515ES | ゴールドバンド 50 bp DNAラダー | 50-1000 bp（14バンド） | ||
| 10507ES | ゴールドバンド 100bp DNAラダー | 100～1500 bp（12バンド） | ||
| 10516ES | GoldBand 100 bpプラスDNAラダー | 100～3000 bp（14バンド） | ||
| 10517ES | ゴールドバンド 200 bp DNAラダー | 200～5000 bp（12バンド） | ||
| 10518ES | ゴールドバンド 500 bp DNAラダー | 500～5000 bp（8バンド） | ||
| 10501ES | GoldBand DL2000 DNAマーカー | 100～2000 bp（6バンド） | ||
| 10504ES | GoldBand DL5000 DNAマーカー | 100～5000 bp（9バンド） | ||
| 10505ES | GoldBand DL10,000 DNAマーカー | 100～10000 bp（10バンド） | ||
| 10511ES | GoldBand フルスケール DNA ラダー | 100～12000 bp（20バンド） | ||
| 10512ES | GoldBand DL15000 DNAマーカー | 250～15000 bp（7バンド） |