核酸抽出は、ほとんどの分子生物学研究室で日常的に行われている手順です。抽出されたDNAまたはRNAは、qPCR、次世代シーケンシング（NGS）ライブラリ調製、逆転写といった下流アプリケーションでよく使用されます。これらの実験を成功させるには、核酸の正確な定量が不可欠です。
では、サンプルに適した定量方法をどのように選択すればよいのでしょうか？一般的に使用されるオプションと、それぞれの適切なケースについて見ていきましょう。
1. ゲル電気泳動：概算
アガロースゲル電気泳動は、分子生物学研究室で最も広く使用されているツールの一つです。サンプルのバンドの強度をDNAラダー（マーカー）と比較することで、グレースケール解析に基づいて核酸濃度を推定できます。
この方法はゲノムDNA（gDNA）には適しています。ただし、RNAやプラスミドDNAには推奨されません。
- RNAサンプル：抽出方法によっては、高品質のRNAでは2つまたは3つのバンドが現れる場合があります。通常は28S、18S、そして場合によっては5S rRNA（TRIzolを使用）、または28Sと18Sのみ（カラムベースのキットを使用）です。直鎖二本鎖DNA用に設計されたDNAラダーは、RNAのサイズや濃度を正確に反映しません。
- プラスミドDNA：プラスミドは、スーパーコイル、開環、直鎖など、複数の構造をとり、通常はゲル上で2つまたは3つのバンドとして現れます。DNAラダーではプラスミドを正確に定量できないため、ゲルを用いた推定は信頼性に欠けます。
2. NanoDrop: 半定量から定量へ
NanoDrop分光光度計は、260 nmにおけるUV吸光度に基づいて核酸の濃度と純度を測定するための一般的なツールです。また、サンプルの純度を評価するのに役立つA260/A280比とA260/A230比も提供します。
- RNA サンプル: NanoDrop は RNA の定量化に広く受け入れられており、ほとんどのラボ アプリケーションで信頼できると考えられています。
- プラスミド DNA: 以前は、NanoDrop がプラスミド定量化の主流でしたが、蛍光ベースの方法 (Qubit など) が利用できるようになったため、多くの研究室が切り替えました。
- ゲノムDNA：NanoDropの結果は大きく異なる場合があります。DNAの場合、NanoDropによる定量結果はQubitと比較して最大数十倍も異なる場合があります。
3. Qubit: 正確な定量化のゴールドスタンダード
Qubitアッセイは蛍光をベースとし、測定対象となる核酸の種類に非常に特異的です。核酸定量において最も正確な方法と考えられています。
市販されている Qubit キットには次のものがあります。
-
DNAおよびRNAの高感度（HS）および広範囲（BR）アッセイ
dsDNA、ssDNA、およびtotal RNAのアッセイ - 核酸の種類と濃度範囲に基づいて適切な Qubit アッセイを選択することで、正確で再現性の高い定量化を実現できます。これは、NGS などの繊細な下流アプリケーションに最適です。
要約: DNA/RNA定量に適した方法の選択
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キュービット |
ナノドロップ |
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BR DNA |
HS DNA |
ss DNA |
BR RNA |
HS RNA |
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一本鎖DNA |
✔ |
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二本鎖DNA |
✔ |
✔ |
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プラスミドDNA |
✔ |
✔ |
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RNA |
✔ |
✔ |
✔ |
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ヒント: 最も正確で一貫性のある定量化のために、特に RNA-seq や低濃度サンプルなどの繊細なワークフローの場合は、分光光度法よりも蛍光ベースの Qubit アッセイが推奨されます。
関連商品：
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製品名 |
カタログ番号 |
サイズ |
応用 |
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12642ES |
100トン/500トン |
dsDNAの定量 ライブラリ定量化 |
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12640ES |
100トン/500トン |
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12645ES |
100トン/500トン |
ssDNAの定量 ライブラリ定量化 |