TRIzol試薬は主にフェノールとグアニジンイソチオシアネートを含みます。これらの成分は細胞を急速に溶解すると同時に、サンプルから遊離したRNaseの活性を阻害します。TRIzolは細胞を破壊し、タンパク質を変性させることで、核酸とタンパク質の分離を可能にします。溶液のpHによって、DNAとRNAが水相と有機相のどちらに分配されるかが決まります。pHが7.0以上の場合、DNAとRNAの両方が水相に存在します。pHが7.0未満の場合は、DNAは変性して中間相または有機相に移動し、RNAは水相に残ります。
TRIzol試薬は酸性（pH 5前後）であるため、相分離中にRNAは上層の水層に留まります。クロロホルムを加えて遠心分離した後、水層を分離し、イソプロパノールを用いてRNAを沈殿させることができます。
図1: TRIzol試薬を用いたmRNA抽出中の相分離
TRIzolは様々な種類のサンプルに幅広く適用可能ですが、抽出中に異常現象が発生する場合があります。以下に、よくある問題、考えられる原因、および推奨される解決策を示します。
1. TRIzol は冷蔵庫から取り出したときには濁って見えますが、後で透明になります。
これは通常正常な現象です。TRIzolにはフェノールやグアニジンイソチオシアネートなどの有機成分が含まれており、低温で白濁することがあります。TRIzolボトルを冷蔵庫内の低温の場所、特に温度が4℃を下回る可能性のある背面の壁付近に保管すると、白濁が生じることがあります。ただし、通常は性能に影響はありません。これを避けるには、TRIzolを冷蔵庫のドア付近など、温度が安定している場所に保管してください。
2. TRIzol でサンプルを均質化した後、不溶性物質が存在します。
これは細胞や組織の破片が原因であることが多く、効率的なRNA回収を妨げる可能性があります。ホモジェナイズ後、室温で5分間インキュベートした後も不溶性物質が残っている場合は、クロロホルムを添加する前に、12,000 × gで10分間、4℃で遠心分離してください。透明な上清とゼラチン状のペレットが現れるはずです。上清を新しいチューブに慎重に移し、プロトコルに従ってください。
3.相分離後の水相の異常な色（例：黄褐色、薄ピンク色、赤みがかった色）。
図2:相分離後の水相の異常な色
これはサンプル固有のものである可能性があります:
- 皮膚組織：脂質とメラニンが豊富です。脂肪滴が色素を運ぶ場合があり、着色した水層を形成します。ホモゲネートをクロロホルム抽出前に遠心分離し、上層の脂質層を除去します。
- 血液を多く含むサンプル：ヘモグロビンは水相に濁りや黄変を引き起こす可能性があります。また、低温で遠心分離を行わない場合、ヘモグロビン中の鉄が有機相を暗色化させる可能性があります。血液の混入を減らすため、サンプルはPBSで前洗浄してください。
- TRIzolの量が不十分：サンプルとTRIzolの比率が1:10を超える場合、特に血液などの液体サンプルでは、相分離が早期に起こり、DNAコンタミネーションが増加する可能性があります。TRIzolを追加するか、液体サンプル用に設計されたTRIzol製剤に切り替えてください。
- 塩分またはタンパク質含有量が多い場合：上記と同様に、これも早期分離を引き起こす可能性があります。サンプルを事前に洗浄するか、TRIzolの量を増やしてください。
4. クロロホルムを添加して遠心分離した後、白い中間層は現れません。
図 3:クロロホルムを添加して遠心分離した後、白い中間相は現れません。
考えられる原因:
- 混合不足：クロロホルムを加えた後、十分にボルテックスしてください。遠心分離前に、混合物は乳白色になっている必要があります。透明の場合は、再度混合し、遠心分離してください。
- サンプル量が少ない場合：サンプル量が少ないと、中間相が薄くなったり、全く見られなくなったりすることがあります。慎重に進め、RNA沈殿を促進するためにグリコーゲンなどのキャリアの使用を検討してください。
5. 遠心分離後、イソプロパノールを添加する前に、チューブの底に沈殿物が形成されます。
これらは多糖類または細胞膜残留物である可能性があります。血液含有量の多いサンプル（例：肝臓）では、赤みがかった粘着性層が現れることがあります。この層には血液由来成分が含まれているため、廃棄してください。上記の水相のみを保管してください。
6. RNA ペレットの色または粘稠度が異常です。
図4: mRNA抽出後のRNAペレットの異常な色または粘稠度
通常、RNAペレットは透明または白色です。異常な色や質感（例：茶色、灰色、ゼラチン状）は、以下の原因で発生することがあります。
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サンプル構成：
- 昆虫：キチン、ワックス、または多糖類を含み、茶色の沈殿物を引き起こします。
- ポリフェノール／多糖類を多く含む組織：着色またはゲル状のペレットが生じる可能性があります。投入量を減らし、粉砕時にPVPを添加するか、そのような組織用に設計されたキットに切り替えてください。
- すでに色のついた水相が観察されている場合は、問題 3 を参照してください。
- 操作ミス：中間層／有機層を誤って吸引するとRNAが混入する可能性があります。水層をクロロホルムで再抽出して精製してください。
7. 沈殿後にRNAペレットが目視できない。
考えられる理由:
- RNA含有量が少ない場合：イソプロパノールを添加した後、4℃または-20℃で10～30分間沈殿させます。それでもペレットが見えない場合は、デカンテーションは避け、見えないペレットの損失を防ぐため、ピペッティングで上清を除去してください。少量サンプルでは、RNA回収率を向上させるために、キャリア（例：グリコーゲンまたは直鎖状ポリアクリルアミド）を添加してください。場合によっては、サケ精子DNAも使用できます。
- 不適切なエタノール洗浄：エタノール濃度が低すぎると、RNAが溶解または失われる可能性があります。ヌクレアーゼフリー水でエタノールを調製した直後のものをご使用ください。
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定量PCR |
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