定量PCR（qPCR）は分子生物学で広く用いられている手法であり、簡単そうに思われがちです。しかし、qPCR実験の成功は、数多くの微妙ながらも重要な要素に左右されます。最も見落とされがちな要素の一つがcDNAテンプレートです。cDNAの質と量が実験の成功を直接左右します。cDNAの調製が不十分だと、qPCRは失敗に終わります。この記事では、qPCRにおけるcDNAの使用について分かりやすく解説し、この最初の重要なハードルを乗り越えるお手伝いをします。（qPCRには他にも多くの技術的な落とし穴があります。今後の記事にご期待ください！）
適切なcDNA量を決定する方法
1. Nanodrop で cDNA 濃度を測定できますか?
推奨されません。逆転写産物は、転写されていないRNA、酵素、cDNA、そして様々な塩やイオンを含む複雑な混合物です。NanodropのようなUV吸光法では、RNAとDNAを区別できず、タンパク質や塩の夾雑物の影響を受けやすいため、測定濃度は不正確となり、下流のqPCR定量には適していません。
2. ゲル電気泳動で cDNA の品質を評価できますか?
ほとんどありません。total RNAには様々なサイズの転写産物が含まれているため、cDNA産物はアガロースゲル上でスメア状に現れます。さらに、逆転写はPCRのように物質を増幅しないため、cDNAの収量全体は低くなります。バンドが薄く、あるいは見えなくなることもあります。
（例：ゲル電気泳動によるcDNAスメアパターン — 画像ソース：インターネット）
3. 最適な cDNA 希釈率を決定するにはどうすればよいでしょうか?
cDNAの希釈系列を作成し、それぞれに対してqPCRを実施します。Ct値が15～30サイクルの範囲になる希釈度を選択します。これが理想的な範囲です。
あるいは、希釈していないcDNAから始めて、初期のCt値に基づいて調整することもできます。Ct値はテンプレート量と対数的に相関するため（ΔCt = 1 = 濃度差の2倍）、適切な希釈率を逆算できます。
例: Ct = 12 は低すぎます。Ct = 16 を得るには、2⁴ = 16 倍に希釈します。
4. 標的遺伝子と参照遺伝子の Ct 値が大きく異なる場合はどうなりますか?
同じ希釈率を使用しているにもかかわらずCt値に有意な差がある場合、遺伝子発現に大きな差があることを示唆しています。標的遺伝子と参照遺伝子の希釈率をそれぞれ変更することで、両方のCt値が15～30の範囲内に収まるようにすることができます。ただし、各遺伝子において、すべての実験群で希釈率が一定であることを確認してください。
高品質のcDNAを得る方法
1. RNAの抽出と保存
新鮮なサンプルは液体窒素で急速凍結するか、RNA安定化試薬で保存してください。-80℃で保存し、凍結融解の繰り返しを避けてください。
TRIzolまたは市販のキットを用いてRNAを抽出します。適切な個人用保護具（PPE）とRNaseフリー認証済みの消耗品を使用し、RNaseフリー環境で作業してください。
RNA を RNase フリー水に溶かし、短期的には -20°C で、長期的には -80°C で保存します。
純度を評価するにはUV吸光度（A260/280 ≥ 2.0、A260/230 ≈ 1.8～2.1）を使用します。ただし、この方法ではRNAの完全性は評価できません。分解や夾雑物の有無を確認するには、ゲル電気泳動をお勧めします。
(高品質の RNA ゲルでは、5S、18S、28S バンドが明瞭に表示されます。28S バンドの強度は 18S の 2 倍になるはずです。)
2. ゲノムDNAの汚染を除去する
ゲノムDNA（gDNA）の混入は、非特異的増幅や異常に低いCt値につながる可能性があります。イントロンをまたぐプライマーと、DNA除去抽出キット、またはgDNA除去ステップを含む逆転写キットを使用してください。
3. 適切な逆転写プライマーを選択する
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プライマータイプ |
特徴 |
長所 |
短所 |
組み合わせ法 |
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オリゴ(dT) |
12～20 T塩基、ポリAテールに結合する |
完全長cDNA合成 |
ポリアデニル化mRNAのみ；テンプレートの品質に敏感 |
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ランダムプライマー |
6～9塩基、ランダムに結合する |
複雑/低濃度テンプレートに適しています |
特異性が低く、断片が短い |
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遺伝子特異的プライマー（GSP） |
特定のRNA配列に結合する |
高い感度と特異性 |
ターゲット特異的なcDNAのみを生成する |
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mRNA qPCR の場合、オリゴ (dT) プライマーとランダムプライマーの組み合わせが一般的に推奨されます。
関連製品
Yeasenが提供する製品は以下の通りです。
表1. 関連製品
| 製品の位置付け | 製品名 | SKU |
| 逆転写酵素 | Hifair™ Ⅲ逆転写酵素（200 U/μL）（RT-LAMP法および高速RT法用） | 11111ES |
| Hifair™ V 逆転写酵素 (200 U/μL) （RT-qPCR用） | 11300ES | |
| Hifair™ IV 逆転写酵素 (200 U/μl) （NGS用） | 11112ES | |
| Hifair™ V 逆転写酵素 | 11301ES | |
| マウスRNase阻害剤 | マウスRNase阻害剤（40 U/µL） | 10603ES |
| マウスRNase阻害剤（200 U/µL、グリセロールフリー） | 10703ES | |
| ホットスタートTaq DNAポリメラーゼ | Hieff Unicon™ ホットスタート ダイレクト Taq DNA ポリメラーゼ、50 U/μL | 10718ES |
| Hieff UNICON™ ホットスタート E-Taq DNA ポリメラーゼ、5 U/μL |
10726ES |
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方法 |
製品 ポジショニング |
製品名 |
猫＃ |
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染料ベースのqPCR |
高特異性ユニバーサル定量プレミックス（染料ベース） |
Hieff UNICON™ アドバンス qPCR SYBR マスターミックス |
11185ES |
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高感度ユニバーサル定量プレミックス（染料ベース） |
11184ES |
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逆転写 |
5分間のワンステップ消化および逆転写プレミックス（qPCR用） |
11151ES |
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5分間の高速逆転写、最大14 kbのcDNA合成が可能、gDNA除去機能付き（PCR/qPCR用） - トレーサーバージョン |
Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA合成キット |
11149ES |
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|
5分間の高速逆転写、最大14 kbのcDNA合成が可能、gDNA除去付き（PCR/qPCR用） |
11150ES |
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高品質のファーストストランドcDNA合成プレミックス（gDNA除去機能付き、qPCR用） |
Hifair™ III 1st Strand cDNA合成スーパーミックス（qPCR用）（gDNAダイジェスタープラス） |
11141ES |