よくある問題

考えられる原因

ソリューション

陽性対照および検査対象サンプルにはバンドがありませんでした。

PCR反応システムまたは反応条件が適切ではありませんでした。

グラジエント PCR を使用して、PCR に最適な反応条件を探ります。

PCR 試薬を不適切に保管すると、試薬が不活性化されます。

2×PCRミックスは-20℃で保管してください。使用時には凍結融解を繰り返さないでください。頻繁に使用する場合は、短期間であれば4℃で保管できます。

プライマー設計の問題。

プライマーを再設計して確認してください。

陽性コントロールには対象のバンドがあり、テスト対象のサンプルにはバンドがないか、または弱いバンドがあります。

溶解バッファーと中和バッファーの比率が不適切で、溶解混合物が PCR システムの pH 値に影響を与えます。

通常の条件下では、中和された溶解混合物の pH は約 7 ～ 8 になります (溶解産物と緩衝液 P2 は 5:1 の比率に厳密に従って中和する必要があります)。

サンプル溶解混合物が不適切にまたは長期間保管されたため、DNA ゲノムが劣化しています。

溶解液ミックスは 4°C で 5 日間保存できます。PCR には新しく調製した溶解液ミックスを使用するようにしてください。

追加されたテンプレートの量が適切ではありません。

反応システムの 5% 未満の範囲内でテンプレートの添加量を最適化します。

PCRサイクル数が不十分です。

PCRサイクル数を適切に増やしてください。推奨は35～40サイクルです。テンプレートの複雑さを考慮すると、精製DNAテンプレートを使用する場合よりも、PCR反応を5～10サイクル多く行う方が一般的に効果的です。

非特異的増幅

PCR アニーリング温度が低すぎる、サイクル数、プライマー濃度、またはテンプレート濃度が高すぎる。

PCR アニーリング温度を上げ、PCR サイクル数、プライマー濃度、またはテンプレート濃度を下げます。

PCRプライマーが一致しません。

PCRプライマーを再設計します。

PCR 反応系を準備する際の温度が高すぎるか、準備後の放置時間が長すぎます。

PCR反応系の準備は低温で行われ、準備が完了したらできるだけ早くPCR増幅反応が行われます。

ネガティブコントロールにターゲットバンドが現れる

操作ツールまたは試薬の汚染。

実験に使用するすべての試薬および器具はオートクレーブ処理する必要があります。標的配列がサンプルガンに吸い込まれたり、遠心管からこぼれたりしないよう、取り扱いには十分注意し、丁寧に扱ってください。

サンプル間の相互汚染。

各サンプラーは 1 つのサンプルのみに使用します。または、1 つのサンプルを採取した後、サンプラーのブレードを 2% 次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸し、繰り返しすすいだ後、きれいなペーパータオルで残留物を乾燥させます。