次世代シーケンシング（NGS）は遺伝子発現の研究方法を変革し、mRNAシーケンシング（mRNA-Seq）はトランスクリプトミクス研究の基盤となっています。NGSを初めてご利用になる方にも、ワークフローを改善したい方にも、このガイドはmRNAライブラリ調製のあらゆるステップを、精製からよくある落とし穴まで丁寧に解説します。
mRNA-Seq とは何ですか? なぜ重要なのですか?
mRNA-Seqは、研究者がトランスクリプトームを捕捉することを可能にし、遺伝子発現、選択的スプライシング、そして新規転写産物の発見に関する知見を提供します。がん研究、発生生物学、そして個別化医療において強力なツールとなります。
ステップ1 ：mRNAの精製
mRNA を精製する理由は何ですか?
トータルRNAには、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、その他の非コードRNAが含まれています。正確なmRNA-Seqを行うには、通常、以下の方法でmRNAを濃縮する必要があります。
- オリゴ(dT)磁気ビーズ: mRNAのポリAテールを捕捉します。
- rRNA 除去キット: 分解されたサンプルやポリアデニル化 mRNA のない種に役立ちます。
図 1. 人間の組織または細胞から抽出された全 RNA におけるさまざまな RNA タイプの分布を示す円グラフ。
ポリ(A)精製：真核生物mRNA濃縮の重要なステップ
真核生物のmRNAのほとんどは3'末端にポリA鎖を有しており、これが原核生物のmRNAと異なる点です。このポリA鎖により、mRNAの容易かつ選択的な精製が可能になります。
最も一般的な方法は、オリゴ(dT)磁気ビーズを用いてtotal RNAからmRNAを特異的に結合・捕捉する方法です（図2参照）。このアプローチはシンプルで効率的であり、広く用いられています。
もう一つの選択肢は、逆転写反応中にオリゴ(dT)プライマーを用いてmRNAを標的とすることです。ただし、この方法は特異性が低く、効率も低いため、ほとんどの場合、磁気ビーズを用いた精製法が好まれます。
図 2. オリゴ (dT) 磁性ビーズは真核生物 mRNA のポリ (A) テールに特異的に結合します。
rRNA除去法：ポリ(A)選択が不可能な場合
ポリ(A)末端を持たないサンプル（原核生物RNAや分解されたトータルRNA（FFPEサンプルなど）など）では、ポリ(A)末端に基づく濃縮は不可能です。このような場合、rRNA除去によってmRNAを濃縮します。
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カテゴリ |
プローブハイブリダイゼーション（Ribo-Zero） |
RNase H消化（最もよく使われる） |
ワンステップrRNAブロック（RTブロッカー） |
磁気ビーズを用いたrRNA除去 |
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原理 |
種特異的プローブは rRNA とハイブリダイズし、ストレプトアビジン ビーズを介して除去されます。 |
DNA プローブ + RNase H は DNA-RNA ハイブリッド内の rRNA を消化します。 |
ブロッカープローブは rRNA の逆転写を防ぎます。 |
ビオチンプローブは rRNA にハイブリダイズし、磁気ビーズによって除去されます。 |
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利点 |
効率が高く、特異性も優れ、種を超えて機能します。 |
特異性が高く、効率的で、種を超えて機能します。 |
高速（3 分）、シンプルなワンステップ、精製不要、高検出。 |
非常に効率的、幅広い種との適合性、高い特異性。 |
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制限事項 |
種固有のプローブが必要です。 |
種特異的な DNA プローブが必要です。 |
専用のキットが必要です。 |
コストが高くなります。 |
図3. rRNA除去の模式図
ステップ2：mRNAの断片化戦略
mRNA の精製後、NGS ライブラリを構築するための主な戦略は 2 つあります。
1)逆転写を先に行い、cDNAの断片化を後で行う：
まず、オリゴ(dT)プライマーを用いてmRNAを逆転写し、長鎖cDNAを生成します。次に、cDNAを二本鎖cDNA（dsDNA）に変換し、酵素消化または機械的剪断によって断片化します。その後、標準的なDNAライブラリワークフローに従ってライブラリを調製します。
2)まずmRNAの断片化、次に逆転写：
mRNAはまず、アルカリ処理、金属イオン処理（Mg²⁺またはZn²⁺）、酵素消化（例：RNase III）などの方法を用いて断片化されます。断片化後、RNAの分解を防ぐため、直ちに第一鎖cDNA合成を行う必要があります。
金属イオンの断片化の場合、希望する断片サイズに応じて条件を調整できます。
- 150～200bp: 94℃、15分
- 200～300bp: 94℃、10分
- 250～550bp: 94℃、5分
これら2つのアプローチでは、トランスクリプトのカバレッジ設定が異なります。詳細は下の図をご覧ください。
図4.異なるライブラリ調製方法による転写産物カバレッジのバイアス。
赤い線は逆転写前の RNA 断片化を表し、緑の線は逆転写後の cDNA 断片化を表します。
逆転写前にmRNAを断片化すると、主に遺伝子本体を均一にカバーするシーケンスリードが生成されます。一方、オリゴ(dT)プライマーを用いた逆転写では、転写産物の3'末端に偏ったリードが生成される傾向があります。そのため、mRNA-Seqでは、より均一な転写産物カバレッジを得るために、まずmRNAを断片化してから逆転写を行うことが一般的に推奨されます。
ステップ3：二本鎖cDNAの合成
mRNAライブラリ構築には、主に標準ライブラリ（非鎖特異的ライブラリ）と鎖特異的ライブラリの2種類があります。主な違いは、セカンドストランドcDNA合成時に使用されるヌクレオチドにあります。
- 標準ライブラリの場合、通常の dNTP が使用されます。
- 鎖特異的ライブラリの場合、第2鎖合成時にdNTPミックス中のdTTPがdUTPに置き換えられます。これにより、第2鎖にウラシルが組み込まれます。
その後、ウラシルを含む鎖を選択的に除去することで、鎖特異性を実現できます。これは通常、以下の手順で行われます。
- ウラシル含有鎖の増幅を阻害する酵素を使用するか、
- ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) で処理して、ウラシルを含む鎖を分解します。
mRNAライブラリの調製を成功させるための重要なヒント
mRNA ライブラリの準備中によくある落とし穴を避けるための便利なヒントをいくつか紹介します。
ヒント1: mRNAライブラリの調製には、RNAの完全性が非常に重要となります。ほぼ完全なmRNAのみが、信頼性の高い高品質なライブラリを生成できます。
ヒント2: ポリ(A)磁気ビーズ精製法を用いる場合、ビーズは3'ポリ(A)末端付近の配列を捕捉することに注意してください。mRNAが分解されている場合、5'末端を含む断片は捕捉されず、洗浄中に失われます（図8参照）。その結果、3'末端に偏ったデータが得られます。
ヒント3: 可能な限り完全な mRNA 分子を配列決定するには、ライブラリの準備の前に RNA 品質管理を実行します。
Agilent Bioanalyzer 2100などの機器を用いて、18Sおよび28S rRNAのピークを解析することでRNAの完全性を評価します。シャープで高いピークは、分解が少なく、完全性が高いことを示します。
本装置はRNA Integrity Number（RIN）を0（分解）から10（無傷）の範囲で表示します。最良の結果を得るには、RINが8.0以上のRNAサンプルを使用してください。
製品リスト
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カテゴリ |
名前 |
カタログ番号 |
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RNAライブラリの準備 |
デュアルモード（ストランド固有および非ストランド固有） |
12308ES |
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プレミックスバージョン |
12340ES |
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Hieff NGS™ EvoMax RNA ライブラリー調製キット（ dNTP ）（プレミックス・シーリングバージョン） |
12341ES |
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mRNAの分離 |
真核生物のmRNA |
12629ES |
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rRNA枯渇 |
ヒト/マウス/ラット |
12257ES |
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ヒト/マウス/ラット |
12254ES |
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12602ES |
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