ようやく貴重なライブラリ調製を終え、シーケンシングに送ったと思ったら、悪夢が待っていました。QCレポートに「FAILED（不合格）」と表示されてしまったのです。一体何が起きたのでしょうか？ピーク幅が広い、ピークが乱れている、短い断片、スメア、アダプターダイマー、コンタミネーション、それとも濃度不足でしょうか？
では、高品質なシーケンシングライブラリとはどのようなものでしょうか？そして、さらに重要なのは、ライブラリの成功率をどう向上させるかということです。
図書館 QC 101: 本当に重要なことは何ですか?
ライブラリ QC には 2 つの重要なチェックポイントがあります。
1. 図書館の集中
これは通常、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素を用いたQubit dsDNAアッセイを用いて測定されます。これらの色素は標的分子に結合した場合にのみ蛍光を発するため、非常に正確な定量が可能です。
✅ ほとんどのシーケンシングプラットフォームでは、ライブラリ濃度が ≥ 2 ng/μL である必要があります。
ただし、濃度テストに合格したからといって、ライブラリがシーケンスの準備が整ったわけではありません。サイズ分布が適切でない場合、実際に使用可能なライブラリ濃度は報告されているよりもはるかに低くなる可能性があります。
2. ライブラリのサイズ分布
ここで最も一般的に使用されるツールは、マイクロ流体キャピラリー電気泳動を活用する Agilent Bioanalyzer です。
仕組みは以下のとおりです:
- 電圧により、サンプルは小さなエッチングされたマイクロチャネルを通過します。
- DNA 断片は移動しながらサイズによって分離されます。
- 蛍光染料は二本鎖 DNA に結合し、レーザーによって励起されて検出可能な信号を生成します。
- 結果: DNA 断片のサイズの分布を示す電気泳動図、つまりライブラリの指紋が作成されます。
以下の方法を使用してモル濃度を推定することもよくあります。
ライブラリモル濃度（pmol）≈質量（ng）/ [0.66 × 平均断片サイズ（bp）]
✅ 「良い」図書館とはどのようなものでしょうか？
PE150 シーケンス (ペアエンド 150 bp) の場合、高品質のライブラリは次の基準を満たす必要があります。
- 主なピークは300～600bpの間
- 正規分布に似た滑らかなベル型曲線
- 目に見えるアダプターダイマーやプライマーダイマーのピークは見られない
- バックグラウンドノイズや二次ピークが最小限
図1. 認定されたシーケンシングライブラリの代表的な電気泳動図
アダプターダイマー、スメア、謎のピーク？電気泳動図からわかること
ライブラリのQCを終えたばかりなのに、エレクトロフェログラムが…怪しい。本来あるべき場所に小さなピークがあったり、幅が広すぎる大きな突起があったり、あるいは複数のピークがコンタミネーションを示唆している場合もあります。ライブラリQCでよくある失敗例、その発生原因、そして最も重要な、その修正方法について見ていきましょう。
1. アダプターコンタミネーション / 短いフラグメントの汚染 (15～270 bp)
これは、ライブラリがQCに不合格となる最も一般的な理由です。残留アダプターや短いフラグメントは、シーケンス中に優先的にクラスター化する傾向があり、フローセル内の貴重なスペースを占有します。その結果、全体的な収量が低下し、使用可能なデータが減少することになります。
短いフラグメント領域がライブラリピーク全体の 3% を超える場合、ライブラリは拒否される可能性があります。
考えられる原因:
劣化したサンプル – 断片化されたり不鮮明になったりした入力により、短いジャンクが増えます。
→ 新鮮なサンプルを使用し、断片化条件を最適化します。
不適切なビーズ選択比率 - サイズの選択が重要です。
→ 不要なフラグメントをより適切に除外するためにクリーンアップ比率を調整します。
過剰なアダプターの追加 – アダプターの過負荷により、精製が効率化されません。
→ ダイマーの残留を避けるために、入力量に基づいてアダプターを希釈します。
図2. アダプターダイマーと短いフラグメントによるライブラリの汚染
2. ピークの遅れ: ライブラリが適切に減少しない場合
電気泳動図上の問題のあるライブラリの最も一般的な兆候の 1 つは「テーリング」です。つまり、メインピークがベースラインにきれいに戻らず、片側が非対称またはにじんで見えることです。
末尾の領域が全体の分布の 40% 以上を占める場合、ライブラリは末尾の問題があるとしてフラグが付けられ、QC 不合格とみなされる可能性があります。
尾引きの考えられる原因:
1)ゲル切除範囲の不適切
ゲルベースのサイズ選択を使用している場合、広すぎるフラグメント範囲やターゲット外のフラグメント範囲を選択すると、望ましくないサイズのキャリーオーバーが発生する可能性があります。
2)反応混合物中の塩分濃度が高い
抽出または洗浄からの残留塩はポリメラーゼのパフォーマンスに影響を与え、断片の品質に問題を引き起こす可能性があります。
→ ライブラリを準備する前に、追加の核酸精製ステップを検討してください。
3)PCR中の過剰増幅
サイクルが多すぎるかプライマーが不十分だと非特異的増幅が発生し、収量が低下し、ピークが不鮮明になる可能性があります。
→ プライマー濃度を最適化し、過剰な PCR サイクリングを回避します。
図3 テーリングライブラリプロファイルを示す電気泳動図
3. ピークが広い = 断片化の問題
ライブラリが「ぽっちゃり」しているように見え、ピークの始まりと終わりが想定されるサイズ範囲を超えている場合は、断片化の問題であることが多いです。理想的には、ピークは密集しており、約300～600bp（PE150の場合）の中心に位置するべきです。
考えられる原因:
最適ではない断片化条件 – 高温、長時間、または酵素が多すぎる。
→ 断片化設定をターゲット サイズに合わせて調整します。
ビーズ洗浄比率が正しくない –
→ サイズ選択プロトコルを調整してピークを引き締めます。
低品質の DNA/RNA 入力 – ゲル上のバンドが劣化または汚れている。
→ そのままの高品質の出発原料を使用します。
図4. 異常なフラグメント分布：ブロードピーク
4. 多重ピーク/ミステリーピーク（二重ピークまたは非標的ピーク）
電気泳動図に複数のピーク（特に非ターゲット断片サイズ）が示される場合、汚染またはサイズ選択の不備が発生している可能性があります。
考えられる原因:
サンプルの相互汚染 – チップ、チューブの共有、またはピペッティング エラーによる。
→ ラボの慣例を確認し、サンプルごとにチップを交換してください。
不適切なサイズ選択 –
→ 清掃条件が適切でない場合、大小さまざまな破片が侵入する可能性があります。
図5 異常なライブラリプロファイル：混合ピーク
これらすべてを回避するにはどうすればいいでしょうか? より良いキットから始めましょう。
こうした問題の多くは次のような原因で発生します。
- 低品質または劣化したDNA/RNA
- 一貫性のない断片化
- 非効率的なアダプターライゲーション
- 不十分な浄化
そのため、堅牢で最適化されたライブラリ準備キットを選択することが非常に重要です。
✅ Yeasen の 12927 および 12972 シリーズなどの高品質 DNA および RNA ライブラリ準備キットは、一般的な障害点を最小限に抑え、バイオアナライザーでの予期せぬ結果が少なく、スムーズで対称的な高収量のライブラリを提供するように設計されています。
あなたの峰々が清らかで、あなたの房が豊かでありますように
QCの苦労は確かにありますが、解決可能です。適切なプロトコル、適切なコントロール、そして高性能な試薬を使用すれば、自信を持ってシーケンス準備の整ったライブラリーを作成できます。
関連製品
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カテゴリ |
名前 |
カタログ番号 |
注記 |
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DNAライブラリ調製キット |
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12972ES |
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RNAライブラリ調製キット |
12308ES |
ストランド特異性と非ストランド特異性 |
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12340ES |
ストランド特異性 |
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12341ES |
非ストランド特異性 |
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12257ES |
ヒト/マウス/ラット |
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12254ES |
植物 |
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12629ES |
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