急速な技術進歩の時代において、 DNAの世界のデコーダーとして機能する次世代シーケンシング（NGS）ライブラリー調製技術は、ますます重要な役割を果たしています。がん遺伝子検出、遺伝性疾患スクリーニング、マイクロバイオーム研究などの分野で大きな価値を実証し、科学研究と臨床医学に革命的な変化をもたらしています。
NGSワークフローは、核酸抽出 → ライブラリ調製 → 標的捕捉 → シーケンシング → バイオインフォマティクス解析という大まかな流れを網羅しています。ライブラリ調製技術の中核は、標的DNA/RNA分子をハイスループットシーケンシング装置と互換性のあるライブラリに変換し、重要な生物学的情報を含む配列データを取得することにあります。
図1: NGSワークフロー
DNAライブラリ構築を例に挙げます。ワークフローは、 DNA断片化 → 末端修復とAテーリング → アダプターライゲーション → 精製とソーティング → ライブラリ増幅 → ライブラリ精製 から構成されます。
図2: DNAライブラリ構築ワークフロー
DNAの断片化
現在のNGSプラットフォームでは読み取り長が限られているため、抽出したDNAサンプルは断片化する必要があります。これは通常、酵素的または機械的な手法によって行われます。
- 機械的破砕： 厳密なサイズ分布と最小限の配列バイアスを備えた DNA 断片を生成します。これは、若干コストは高くなりますが、ライブラリ準備における断片化のゴールド スタンダードと考えられています。
- 酵素による断片化： 配列に依存しない断片化酵素を使用することで、複雑な機械装置を必要とせず、安定した断片化結果を提供します。得られる断片のサイズは、酵素消化時間のみに依存します。
注目すべきは、様々な断片化酵素が存在するものの、そのほとんどがエンドヌクレアーゼの原理に基づいて作動することです。これらの酵素の中でも、 Tn5トランスポザーゼは超高速ライブラリ構築能力によりNGS市場で依然として優位に立っていますが、固有の配列バイアスが適用範囲を制限しています。DNase I、エンドヌクレアーゼV、そしてフラグメント酵素（複数の酵素を混合したもの）などの酵素は有望ですが、広範な導入を阻む制約があります。フラグメント酵素は現在、NGSにおける最も広く認知された酵素断片化法です。
表1：様々な断片化酵素の原理と限界
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酵素クラス |
DNA分解酵素1 |
エンドヌクレアーゼV |
フラグメンターゼ |
Tn5 |
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構成 |
単一酵素 |
単一酵素 |
酵素混合物 |
単一酵素 |
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タイプ |
エンドヌクレアーゼ |
エンドヌクレアーゼ |
エンドヌクレアーゼ |
トランスポザーゼ |
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原理 |
さまざまな陽イオン条件下で DNA をランダムに分解して、必要なサイズの断片にします。 |
DNA 内のウラシル含有量を調整することで DNA 消化の長さを制御します。 |
1 つの酵素が DNA に切れ目を入れ、もう 1 つの酵素が切れ目を認識して相補鎖を切断し、DNA を目的のサイズに断片化します。 |
特定の部位でのトランスポゾン媒介挿入によりランダムな DNA 断片を生成します。 |
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制限 |
実験は複数の要因の影響を受け、再現性が低下します。また、切断部位に配列バイアスが見られます。 |
サンプルのGC含量は、配列構成の違いにより、断片化効率に影響を及ぼす可能性があります。また、実際の操作も複数の要因の影響を受けます。 |
/ |
挿入部位を挟む 9 塩基対に配列の偏りが見られます。 |
端部修理とAテーリング
断片化されたDNAは、5' / 3'オーバーハングまたは平滑末端を有する場合があります。すべてのオーバーハングは平滑末端に変換する必要があります。つまり、3'オーバーハングはトリミングされ、5'オーバーハングはフィルインされます。TAクローニング戦略を用いたその後のアダプターライゲーションでは、DNA断片の5'リン酸化と3'末端への単一の「A」ヌクレオチドの付加が必要です。これにより、単一の3'「T」オーバーハングを備えたアダプターとのライゲーションに適した末端が作成されます。これらの酵素ステップは、 T4 DNAポリメラーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、およびTaq DNAポリメラーゼによって協調的に実行されます。
アダプターライゲーション
アダプターはシーケンシングライブラリの重要な構成要素です。一般的に使用されるY字型のイルミナアダプターを例に挙げると、 P5/P7フローセル結合配列、サンプルマルチプレックス用のインデックス配列、そしてRd1/Rd2 SP結合部位が含まれています。
- P5/P7 配列はフローセル上の相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ブリッジ増幅のために断片を固定します。
- インデックスは、シーケンシング中にプールされたライブラリ内のサンプルを区別することを可能にします。ライゲーションは通常、T4 DNAリガーゼによって触媒され、二本鎖DNAの切断部分を修復し、アダプター（3' 'T' オーバーハングを持つ）をA末端DNA断片に結合させて、完全な二本鎖分子を形成します。
シーケンシング技術の進歩に伴い、アダプターの設計は多様化しており、シングルエンド／ペアエンドアダプター、UMIアダプター、トランスポザーゼ対応アダプター、全長／ショートアダプターなどがあり、多様なアプリケーションに対応しています。アダプターは以下のように分類できます。
- プラットフォーム: Illumina アダプター、MGI アダプター。
- タイプ:フルレングス(長い)アダプタ、スタッビー(短い)アダプタ。
- インデックス戦略: CDI (Combinatorial Dual Index) アダプター、UDI (Unique Dual Index) アダプター。
図3: IlluminaおよびMGIプラットフォームにおけるシングルインデックスライブラリ構築
図4: IlluminaおよびMGIプラットフォームでのデュアルインデックスライブラリ構築
精製とサイズ選択
このステップでは通常、磁気ビーズを用いた2段階の精製が行われます。ビーズはより大きなDNA断片に優先的に結合するという原理を利用し、ビーズとサンプルの体積比を変化させます。
- 最初の精製:大きな断片と不要な複合体を除去します。
- 2 次精製:小さな断片と残留試薬を除去します。
これにより、ライブラリが目的のフラグメント サイズの範囲内に分離されます。
図5: DNA断片の精製
図6: DNA断片サイズの選択
ライブラリの拡張
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、シーケンシングに十分な量のアダプター連結DNA断片を生成するために用いられます。PCRでは通常、高忠実度DNAポリメラーゼが用いられます。この酵素は、 DNA合成のための5'→3'ポリメラーゼ活性と、増幅中に誤って取り込まれたヌクレオチドを補正する3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有しています。これにより、ライブラリ断片の迅速かつ高忠実度の増幅が可能になります。
DNAおよびRNAライブラリ調製におけるNGSコア酵素のガイドライン
Yeasenは、分子、タンパク質、細胞という3つの主要な生物学的試薬の研究開発、製造、販売を行うバイオテクノロジー企業です。Yeasen Biotech社は、NGSライブラリ構築に関連する様々な酵素を製造しています。以下の表から、最適なライブラリ構築製品をお選びいただけます。
表2. DNAおよびRNAライブラリ構築におけるNGSコア酵素のガイドライン
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タイプ |
製品の位置付け |
製品名 |
猫＃ |
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RNAライブラリの構築 |
rRNA枯渇/2本鎖cDNA合成 |
12906ES |
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rRNA枯渇 |
10325ES |
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1st鎖cDNA合成 |
14672ES |
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HifairTM IV逆転写酵素（お問い合わせ） |
11112ES |
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2本鎖cDNA合成 |
12903ES |
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RNAライブラリ構築とDNAライブラリ構築 |
修理終了 |
12901ES |
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12902ES |
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dA-テーリング |
13486ES |
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アダプターライゲーション |
10301ES |
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PCR増幅 |
12621ES |
表3. DNAおよびRNAライブラリ調製キット
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名前 |
猫＃ |
注記 |
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DNA |
Hieff NGS™ DNA ライブラリ調製キット 2.0 (機械式) |
12927ES |
腫瘍/機械工学法 |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA ライブラリ調製キット V4（酵素） |
12972ES |
腫瘍/酵素法 |
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Hieff NGS ™ OnePot II DNAライブラリ調製キット（イルミナ用） |
13490ES |
Pathgen/酵素/通常時間（140分） |
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12316ES |
Pathgen/酵素/超高速（100分） |
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RNA |
12308ES |
オリゴdT磁気ビーズなし、チューブ11本 |
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12340ES |
プレミックスバージョン（アクチノマイシンDフリー） |
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12254ES |
植物 |
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12257ES |
人間 |