E. coli O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras é usado para análise quantitativa de E. coli O DNA da célula hospedeira reside em amostras intermediárias, produtos semiacabados e acabados de vários produtos biológicos.

Este kit adota a sonda fluorescente Taqman e o método de reação em cadeia da polimerase (PCR), que tem limite mínimo de detecção de nível fg e pode detectar específica e rapidamente o E. coli residual. DNA celular. O kit precisa ser usado junto com o Kit de Preparação de Amostra de DNA Residual (Cat# 18461ES).

Relatório de Validação

Especificações

Componentes

Armazenar

Este produto deve ser armazenado entre -25 e -15℃ por 2 anos.

Tanto 41308-A quanto 41308-B devem ser armazenados protegidos da luz.

Modelos de instrumentos aplicáveis

Inclui, mas não se limita a:

Bio-Rad: Módulo óptico CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Instruções

1. E. coli. Diluição padrão de DNA e preparação da curva padrão

A E. coli O controle de DNA foi diluído em gradiente usando o tampão de diluição de DNA fornecido no kit^*, e a diluição

a concentração é 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL.

Veja instruções detalhadas abaixo:

• Descongele o controle coliDNA e o tampão de diluição de DNA no gelo. Após descongelar completamente, agite suavemente no vórtex para misturar e centrifugue em baixa velocidade por 10 segundos.
• Retire seis tubos limpos de 1,5 mL, marcados com Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5.
• Adicione 90 μL de tampão de diluição de DNA e 10 μL de controle coliDNA ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado Std0, a saber: diluir para 3 ng/μL. Misture e centrifugue por 10 segundos. Embale o padrão de DNA diluído e ele pode ser armazenado em curto prazo (não mais que 3 meses) a -25~-15℃^**.Evite congelamento e descongelamento repetidos.
• Adicione 90 μL de tampão de diluição de DNA em outros tubos^***, então siga o procedimento abaixo para as diluições seriais^****.

Tabela 1 Diluição do gradiente padrão

^*São necessários três poços replicados para cada concentração. O intervalo de detecção é de 30 fg/μL~300pg/μL e esta faixa pode ser expandida.

^**Para reduzir o número de congelamentos e descongelamentos repetidos e evitar contaminação, é recomendável armazenar o controle de DNA em alíquotas a -25~-15℃ pela primeira vez.

^***Após descongelado, o tampão de diluição de DNA pode ser armazenado de 2 a 8 °C por 7 dias. Se não for usado por um longo período, armazene de -25 a -15 °C.

^****Certifique-se de que o modelo esteja completamente misturado, agite suavemente a mistura por 15 segundos a 1 minuto para cada diluição de gradiente.

2. Preparação do Controle de Extração e Recuperação (ERC)

Defina a concentração de DNA de E. coli no ERC conforme necessário (a amostra de ERC foi preparada com 30 pg de DNA de E. coli como exemplo), como segue:

• Adicione 100 μL de amostra de teste em um tubo limpo de 1,5 mL, depois adicione 10 μL de Padrão de DNA de E. coli 3pg/μL (Std3) e misture bem, marcado como ERC.
• Realize a extração de DNA da amostra de ERC junto com as amostras de teste para preparar a amostra de ERC purificada.

3. Preparação da Solução de Controle Negativo (NCS)

Defina o controle negativo no experimento, as etapas específicas da operação são as seguintes:

1) Adicione 100 μL de matriz de amostra (ou tampão de diluição de DNA) em um tubo limpo de 1,5 mL, então marcado como NCS.

2) Realizar a extração de DNA da amostra de NCS juntamente com as amostras de teste para preparar a amostra de NCS purificada.

4. Preparação de Controle de Nenhum Modelo (NTC)

Defina o controle sem modelo no experimento, as etapas específicas da operação são as seguintes:

1) O NTC não requer pré-tratamento de amostra e pode ser configurado no estágio de detecção de qPCR de DNA residual.

2) A amostra de NTC em cada tubo ou poço é de 20 μL de Mix (ou seja, 15 μL de E. coli qPCR Mix + 5 μL de E. coli Primer&probe Mix) + 10 μL de DNA Dilution Buffer. É recomendado configurar três poços replicados.

5. Sistema de reação de PCR

Tabela 2 Sistema de reação

^*Calcule o volume total da reação de PCR pelo número de reações: qPCR Mix =(o número de reações+2) × (15+5) μL (incluindo as perdas de dois poços de reação). Mais de três réplicas para cada amostra são recomendadas no experimento.

^**Após tampar o tubo ou selar a placa, centrifugue o tubo ou placa de reação em baixa velocidade por 10 segundos. Após agitar e misturar o suficiente por 5 segundos, repita a centrifugação para coletar o líquido da tampa ou parede para o fundo. Evite bolhas durante a operação.

Veja a tabela abaixo para a configuração de placa recomendada:

Tabela 3 Placa de referência do computador

O layout da placa inclui: 5 Std (a curva padrão de 5 concentrações padrão), 1 NTC (sem controle de modelo), 1 NCS (solução de controle negativo), 3 TS (amostras de teste), 3 ERC (controle de extração e recuperação).Três poços replicados para cada amostra.

6. Configurar diretrizes para um instrumento de PCR(método de 2 etapas) （por exemplo, instrumento qPCR Thermo ABI 7500, software versão 2.0）

As instruções a seguir se aplicam somente ao instrumento Thermo ABI 7500 qPCR (versão de software 2.0). Se você usar um instrumento diferente, consulte o guia do instrumento aplicável para obter diretrizes de configuração.

1) Gere um novo experimento, escolha o modelo de quantificação absoluta ou definido pelo usuário.

2) Crie 1 sonda de detecção, chamada "E.coli-DNA", selecione o fluoróforo repórter como "FAM" e o fluoróforo de extinção como "Nenhum". A fluorescência de referência é ROX" (a fluorescência de referência pode ser baseada no modelo do instrumento, etc., selecione se você precisa adicioná-la).

3) No painel 'Samples', adicione todas as informações das amostras por vez. Em seguida, selecione os poços, escolha o alvo e as amostras correspondentemente. Defina a tarefa de E. coli Padrão de DNA como padrão e atribua os valores 300000, 30000, 3000, 300, 30 (a unidade de concentração de DNA em cada poço é fg/μL) na coluna Quantidade e nomeie os poços como Padrão 1, Padrão 2, Padrão 3, Padrão 4, Padrão 5, correspondentemente. Defina a tarefa do NTC como NTC. Defina o NCS, TS e ERC como Desconhecido, e nomeou-os de acordo com o layout da Placa acima correspondentemente. Então clique em próximo.

4) Defina o programa de amplificação: defina o volume de reação como 30 μL.

Tabela 4 Procedimento de amplificação

7. Análise dos resultados de qPCR

1) O sistema fornecerá automaticamente o Threshold no painel Amplification Plot da Analysis. O Threshold fornecido pelo sistema às vezes fica muito próximo da linha de base, resultando em uma grande diferença no Ct entre poços replicados. Você pode ajustar manualmente o Threshold para uma posição apropriada e clicar em Analyze. Então, você pode verificar inicialmente se a curva de amplificação está normal no Multicomponent Plot.

2) Na aba Análise de Resultados, revise o gráfico da Curva Padrão. Verifique os valores para o R², Eficiência, Declive e intercepto Y. Para uma curva padrão normal, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Inclinação≤-3,1.

3) No painel 'Exibir tabela de poços' em Análise, as concentrações de cada amostra são mostradas em Quantidade, a unidade é fg/μL e as unidades podem ser convertidas no relatório do ensaio.

4) As configurações de parâmetros da análise de resultados precisam ser baseadas no modelo específico e na versão do software usada e geralmente podem ser interpretadas automaticamente pelo instrumento.

5) Calcule a taxa de recuperação de picos com base nos resultados do teste da amostra TS a ser medida e no ERC de recuperação de picos da amostra. A taxa de recuperação de picos deve estar entre 50% e 150%.Fórmula do medidor de taxa de recuperação aumentada: Recuperação (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Volume de eluição (μL) / Valor teórico da quantidade de adição de DNA (por exemplo, pg) x 100%。

6) O valor de Ct do controle negativo NCS deve ser maior que a média do Ct de menor concentração do padrão.

• O controle livre do modelo NTC deve ser indeterminado ou o valor Ct ≥3

Notas

1. Este produto é somente para uso em pesquisa.
2. Para sua segurança, opere com jalecos e luvas descartáveis.

3. Leia este manual cuidadosamente antes de usar este reagente. O experimento deve ser padronizado, incluindo o manuseio da amostra, a preparação do sistema de reação e a adição da amostra.

4. Certifique-se de que cada componente esteja totalmente agitado no vórtice e centrifugado em baixa velocidade antes do uso.

Manual