Instruções

1. Preparativos antes do experimento

1） Prepare os reagentes e materiais necessários que serão usados ​​no experimento.

2）Confirme a adequação de o instrumento qPCR

Este kit pode ser usado nos seguintes tipos de instrumentos de qPCR:

1. Bio-Rad: CFX96
2. Thermo Scientific: Sistema de PCR em tempo real 7500; QuantStudio™5;
3. Método experimental

1） Extração de DNA

Recomendamos usar ' Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético (Cat#18461ES para extração manual e Cat#18462ES para extração automática) para o Extração de DNA, você pode visita ' http://www.youtube.com/watch?v=gYzQQwww.yeasenbiotech.com ' para o

informações detalhadas e a compra.

O kit (Cat#40619ES) contém um controle interno (IC). Se adicionar o IC às amostras antes da extração de DNA, ele pode verificar o processo completo (incluindo extração de DNA e reação de qPCR). Se adicionar o IC ao master mix de qPCR

diretamente, o CI atuará apenas como um controle qPCR.

2）Preparação da mistura qPCR

1. De acordo com a quantidade de amostra que incluiu controle positivo (PCS), controle sem modelo (NTC), negativo solução de controle (NCS) e amostra de teste (TS) para calcular o número de reações. Prepare 2 reações em paralelo para

cada amostra em geral.

* PCS：Positivo controlar solução；NTC：Não modelo controle；NCS：Negativo controlar solução;TS:Teste amostra. Lá é não precisar para executar

o amostra extração para PCs e NTC, mas NCS e TS são necessário.

Poços de reação（M1）=（1×NCS + N×TS） ×2

Poços de reação (M2) = (1×PCS + 1×NTC) ×2

Poços de reação (M3) = (1×PCS + 1×NTC+ N×TS) ×2

1. Pré-descongele a quantidade necessária de reagentes no gelo de acordo com o desenho do experimento e as tabelas abaixo.
2. Calcule a quantidade de qPCR Mix de acordo com o Número de reações. Observe que, se o kit for usado para atividades de GMP, como liberação de produto, recomendamos usar a Tabela 1 e 2 para a preparação; Se o kit vai apenas usado para pesquisa e não há necessidade de adicionar IC antes da extração após a avaliação, siga a Tabela 3 para

a preparação. Observe que nem todos os M1, M2 e M3 são necessário para ser preparar.

Tabela 1 Sistema qPCR Mix para M1

*O configuração sistema em Mesa 1 é baseado sobre o premissa que CI é adicionado antes extração para ambos NCS e TS, então isto é não necessário

para adicionar CI quando qPCR Mistura preparação. IC adicionando método antes extração: Primeiro, dilua CI por 20 vezes com ADN diluente, e adicionar 1μL

diluído CI em cada 100μL teste amostra para o avançar extração.

**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro

marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição.Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.

Tabela 2 Sistema qPCR Mix para M2

*O configuração sistema em Mesa 2 é baseado sobre o premissa que CI é não adicionado em PCs e NTC antes extração, então CI precisa para ser adicionado durante qPCR Mistura preparação. IC adicionando método depois extração: Diluir CI por 100 vezes com ADN diluente e adicionar 1μL diluído CI em

cada qPCR Mistura sistema.

**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro

marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição. Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.

Tabela 3 Sistema qPCR Mix para M3

*O configuração sistema em Mesa 3 é baseado sobre o premissa que CI é não adicionado para amostras antes extração, então CI precisa para ser adicionado durante qPCR Mistura preparação. IC adicionando método depois extração: Diluir CI por 100 vezes com ADN diluente e adicionar 1μL em cada qPCR Mistura

sistema.

**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro

marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição. Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.

3）Adição de modelos

1. Misture a mistura qPCR com agitação suficiente, centrifugue em baixa velocidade e colete o líquido residual da tampa

para o fundo de o tubo.

1. Adicionar 20 μL qPCR Mix para cada tubo/poço de reação. Observe adicionar o qPCR Mix correspondente em cada

tubos de amostra e evitar adicionar erros.

1. Adicione Templates ao tubo/poços que continham a qPCR Mix. Veja a Tabela 4 para adicionar os templates.

Mesa 4 Modelos adicionando

*Recomendamos usar o tampão de diluição de DNA (40619-E) como modelo de NCS para extração de DNA.

**O total reação volume em cada tubo/poço é 40 μL.

***Cobrir o tubo tampa ou o placa filme. Para evitar afetando o fluorescência sinal lendo, por favor pegar cuidado não para marca o tubo tampa ou filme

ou até esfregar o filme repetidamente com um raspador.

****Centrífuga o reação tubo ou placa brevemente no baixo velocidade depois modelos adicionando. Depois suficiente tremendo e mistura, repetir centrifugar

no baixo velocidade para coletar o líquido de o tampa ou parede para o fundo. Evite bolhas quando operação. A linha de base vai ser impactado se o mistura

é não misturado bem, então esse etapa é muito importante para um bom experimentar resultado.

4）Configuração de programas qPCR

1. Configurações do arquivo de programa

Exemplo (instrumento 7500 Real-Time PCR System e Real-Time PCR Software v2.4):

Tipo de instrumento: 7500 (96 poços)

Tipo de experimento: Quantificação-Curva Padrão;

Química: Reagentes Taqman®

Velocidade de rampa: Padrão (~2 horas para completar uma corrida)

1. Configurações do canal de destino

Em "Definir Alvos e Amostras" de "Placa Configurar", criar um Alvo 1 canal (FAM), selecionar FAM como o relatando grupo de fluorescência e MGB ou nenhum como a têmpera fluorescência grupo. Criar um Alvo 2 canal (VIC), selecionar o relatando fluorescência grupo como VIC e o têmpera fluorescência grupo como nenhum. Em "Atribuir Alvos e Amostras" de "Placa Configurar", se não adicional ROX tingir é adicionado, selecione "nenhum"; Se um adicional ROX é adicionado, selecione

ROXO.

1. Configurações do programa de amplificação padrão

Tabela 5 Configurações do programa de amplificação padrão

1. Definição de linha de base e limite:

Princípio de linha de base ajuste: usar o automático linha de base geralmente. Se precisar para ajustar em manual, escolher o ciclo antes do crescimento exponencial período como o ciclo inicial e evitar a zona de flutuação de inicial fluorescência coleção. Escolha o ciclo que é 1-2 ciclos antes do Ct da amostra de amplificação exponencial mais antiga como o

ponto final.

Princípio de limite ajuste: use o limite automático geralmente. Se precisar ajustar no manual, o limite deve ser definir mais alto que o Negativo amostra ou o linha de base barulho, isso é geralmente definir o limiar em o tarde

estágio de a amplificação exponencial, relativa independente e limiar adequado é necessária para cada túnel.

5） Resultado Análise

1. Julgamento de resultados para PCS, NTC e NCS:

Se IC adicionado: a especificação de cada amostra de controle deve ser satisfeito na Tabela 6:

Mesa 6 Resultado julgamento de PCS, NTC e NCS

Se o IC não for adicionado: cada amostra de controle de qualidade deve atender à especificação da coluna de sinal FAM na Tabela 6, e nenhuma

precisa analisar Canal VIC.

1. Resultado do julgamento para TS

Pré-requisito: Isto é necessário determinar se PC, NTC e NCS passou na especificação na tabela 6 antes do TS análise de resultados. Se aprovado, então pode prosseguir para o próximo passo. Se não passou, o TS resultados poderia não ser confiável, e

o motivo precisa ser investigado.

Se IC adicionado: encontre os resultados correspondentes julgamento de acordo com as informações de resultado do FAM e VIC na Tabela 7:

Mesa 7: Resultado julgamento de TS (CI adicionado)

*Se lá é inibição para VIC sinal,tratamento é necessário para eliminar o inibidores ou repita o teste.

Se IC não for adicionado: encontre os resultados correspondentes julgamento de acordo com as informações de resultado do FAM na Tabela 8 , e não há necessidade de analisar o Sinal VIC.

Mesa 8: Resultado julgamento de TS (CI não adicionado)

Notas

1. Por favor, leia este manual cuidadosamente antes de usar este kit. O experimento deve ser conduzido de forma padronizada, incluindo manuseio de amostra, preparação do sistema de reação e adição de amostra.

2. Mantenha as operações de adição de amostras e preparação de reagentes no gelo, se possível.
3. Agite bem cada reagente no vortex antes de usar.

4. Por favor, opere com jalecos e luvas descartáveis, para sua segurança.
5. Este produto é somente para uso em pesquisa.