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O Cell Counting Kit-8 (CCK-8) é um kit de detecção rápido e altamente sensível baseado no reagente WST-8 (sal monossódico de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)-2H-tetrazólio). O WST-8 é um reagente aprimorado do MTT e pode ser reduzido a um formazan amarelo-alaranjado altamente solúvel em água por desidrogenases nas mitocôndrias. A quantidade de formazan gerada é proporcional ao número de células vivas. O valor de OD do formazan a 450 nm detectado por um leitor de microplacas pode indicar indiretamente o número de células viáveis. Este kit é amplamente utilizado para triagem de medicamentos, ensaios de proliferação celular e citotoxicidade, testes de sensibilidade a medicamentos tumorais e detecção de atividade de fatores biológicos.
Vantagens do método CCK-8
1. Comparação do método CCK-8 com outros métodos de detecção de proliferação/toxicidade celular.
| Método de detecção | Método MTT | Método XTT | WST - 1 método | Método CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Solubilidade em água do produto formazan | Baixo (é necessário adicionar solvente orgânico para dissolver e depois testar) | Alto | Alto | Alto |
| Características do produto | Pó | 2 frascos de solução | Solução | 1 frasco de solução |
| Modo de uso | Misture na solução e use | A solução foi preparada imediatamente antes do uso. | Fora da caixa | Fora da caixa |
| Sensibilidade de detecção | Alto | Muito alto | Muito alto | Alto |
| Detecção tempo | Longo | Curto | Curto | O mais curto |
| Comprimento de onda de detecção | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| citotoxicidade | Alta toxicidade, desaparecimento completo da morfologia celular | Baixa toxicidade, morfologia celular inalterada | Baixo toxicidade, morfologia celular inalterada | Baixa toxicidade, morfologia celular inalterada |
| Estabilidade do reagente | Em geral | Baixo | Em geral | Alto |
| Teste de amostra em massa | Viável | Apropriado | Apropriado | Apropriado |
2. O vermelho de fenol e o soro não interferem na detecção de CCK-8.
3. Como a citotoxicidade do reagente CCK-8 é muito baixa, o tempo ideal de medição pode ser determinado pela leitura repetida com um leitor de microplacas em momentos diferentes após a adição do reagente CCK-8.
Envio e armazenamento
O produto pode ser armazenado entre -25 e -15ºC em local seco e escuro por dois anos.
Precauções
1. No primeiro experimento, recomenda-se determinar o número ideal de células plaqueadas e o tempo ideal de incubação do reagente CCK-8.
2. Se possível, use uma pipeta multicanal para reduzir as variações entre os poços replicados. Evite bolhas no experimento, pois as bolhas interferirão na leitura da DO. Ao adicionar o reagente CCK-8, é recomendado adicioná-lo próximo à parede da placa de cultura em vez de inseri-lo no meio de cultura.
3. Os glóbulos brancos podem exigir um tempo de incubação mais longo.
4. Ao usar uma placa padrão de 96 poços, o número de células plaqueadas é de pelo menos 1.000 células/poço (100 μL). A sensibilidade de detecção para glóbulos brancos é relativamente baixa, então é recomendado plaquear pelo menos 2.500 células/poço (100 μL). Se usar uma placa de 24 ou 6 poços, calcule o número correspondente de células para cada poço e adicione o volume apropriado de reagente CCK-8 (o volume de reagente CCK-8 adicionado é 10% do volume do meio de cultura em cada poço da placa).
5.Se o filtro de 450 nm não estiver disponível, um filtro com absorbância entre 430-490 nm pode ser usado, mas o filtro de 450 nm pode atingir a maior sensibilidade de detecção.
6. O vermelho de fenol não afeta a medição, pois a absorbância do vermelho de fenol no meio pode ser eliminada subtraindo a absorbância do grupo em branco.
7. Para sua segurança e saúde, use jaleco e luvas descartáveis ao operar o experimento.
Instruções
I. Faça uma curva padrão
1. Prepare a suspensão de células, determine a densidade celular e, em seguida, semeie as células.
2. Dilua sequencialmente as células com o meio de cultura de acordo com uma certa proporção (como proporção de 1:2) para formar um gradiente de concentração de células, geralmente 3-5 gradientes de concentração de células, 3-6 poços replicados para cada concentração.
3. Após a plaqueamento, cultive as células por 2-4 horas para torná-las aderentes. Em seguida, adicione o reagente CCK-8, incube por um certo período de tempo e meça o valor de OD. Trace uma curva padrão com o número de células como o eixo X e o valor de OD como o eixo Y. De acordo com essa curva padrão, o número de células em uma amostra desconhecida pode ser determinado (a premissa de usar essa curva padrão é que as condições experimentais devem ser consistentes).
II. Ensaio de viabilidade celular
1. Células de placa (100 μL/poço) em uma placa de 96 poços. Coloque a placa em uma incubadora (37°C, 5% CO2) por um período de tempo para pré-incubação.
2. Adicione 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço (tenha cuidado para não introduzir bolhas nos poços, pois elas interferem na leitura da DO) e misture delicadamente.
3. Coloque a placa na incubadora e incube por 1-4 horas.
4. Meça a absorbância a 450 nm com um leitor de microplacas.
5. Se o valor de OD não for medido imediatamente, adicione 10 μL de solução de HCl 0,1 M ou solução de SDS 1% p/v a cada poço, cubra a placa e armazene-a com proteção contra luz em temperatura ambiente. O valor de absorbância não mudará em 24 horas.
III. Ensaio de proliferação celular e citotoxicidade
1. Células de placa (100 μL/poço) em uma placa de 96 poços. Coloque a placa em uma incubadora (37°C, 5% CO2) por 24 horas para pré-incubação.
2. Adicione 10 μL de diferentes concentrações da substância a ser testada à placa.
3. Coloque a placa na incubadora e incube por um determinado período de tempo (como 6, 12, 24 ou 48 horas).
4. Adicione 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço (tenha cuidado para não introduzir bolhas nos poços, pois elas interferem na leitura da DO) e misture delicadamente.
5. Coloque a placa na incubadora e deixe incubar por 1-4 horas.
6. Meça a absorbância a 450 nm com um leitor de microplacas.
7. Se o valor de OD não for medido imediatamente, adicione 10 μL de solução de HCl 0,1 M ou solução de SDS 1% p/v a cada poço, cubra a placa e armazene-a com proteção contra luz em temperatura ambiente. O valor de absorbância não mudará em 24 horas.
Observação: Se a substância estiver oxidando ou redutora, substitua o meio de cultura antigo por meio novo (remova o meio antigo, lave as células duas vezes com meio novo e depois adicione meio novo) antes de adicionar o reagente CCK-8 para eliminar o efeito da substância.Se a substância em si tiver apenas um pouco efeito no valor de absorbância, não há necessidade de substituir o meio de cultura e o efeito da substância pode ser eliminado subtraindo o valor de absorbância de um grupo em branco com a substância.
Fórmula de cálculo
Taxa de sobrevivência celular =[(AC) /(BC)] x100%
Taxa de inibição =[(BA) /(BC)] x100%
A: A absorbância do grupo experimental (a absorbância do meio de cultura contendo células, reagente CCK-8 e a substância a ser testada)
B: A absorbância do grupo controle (a absorbância do meio de cultura contendo células, reagente CCK-8)
C: A absorbância do grupo em branco (a absorbância do meio de cultura contendo o reagente CCK-8)
Citações
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