HEK293 Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G)
Resumo da qualificação (Cat No.: 41331(ES60)
- Fundo
Os dados resumidos neste relatório são realizados pela
A
- Materiais e métodos experimentais
2.1 HEK293 Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G), Fornecedor:
2.2 Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure®, fornecedor:
2.3 Dados originais: a versão eletrônica foi registrada no 'Relatório Experimental' o subarquivo do arquivo pai 'HEK293 Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G)'.
2.4 Métodos: Os materiais e métodos de operação utilizados no experimento foram basicamente produzidos ou definidos pela
- Conteúdos e resultados da qualificação
3.1 Alcance de detecção
A faixa linear do kit foi de 30 fg/μL~300 pg/μL com R2≥0,998, e a eficiência de amplificação foi de 90%~110% com CV<15% para cada ensaio de concentração.
Figura 1 Curva padrão de qPCR de DNA HEK293 (3G)
3.2 Precisão
3.2.1 Rrecuperação
3.2.1.1 Experimento de recuperação de picos de amostra em branco
Amostras de HEK293 Padrões de DNA em altas e baixas concentrações: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL foram preparados, respectivamente, e analisados após a extração usando o Método de Esferas Magnéticas para o Kit de Pré-tratamento de Amostras Residuais de DNA (2 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra, e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração), e as recuperações e CVs das amostras foram analisados.
Para diferentes concentrações de amostras de DNA, as recuperações variaram de 70% a 130%, e os CVs foram todos <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra em branco | / | / | / | / | / | / |
| Amostra de recuperação 1 | 300 pg/μL | 306,81 pg/μL | 279,57 pg/μL | 293,82 pg/μL | 6,56% | 97,94% |
| Amostra de recuperação 2 | 3 pg/μL | 3.11 pg/μL | 2,99 pg/μL | 3.09 pg/μL | 2,75% | 103,00% |
| Amostra de recuperação 3 | 30 fg/μL | 31.02 fg/μL | 30,63 fg/μL | 30,83 fg/μL | 0,89% | 102,77% |
Tabela 1 Recuperação de picos de amostra em branco
3.2.1.2 Experimento de simulação de recuperação de pico de amostra
Amostras da mesma concentração (3 pg/μL de DNA HEK293) foram extraídas (2 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração) com 5 soluções de fundo diferentes (alta proteína, alto ácido nucleico, alto e baixo pH, alto sal) e as recuperações de amostra e CVs foram analisados.
As recuperações de amostras de DNA para diferentes soluções de fundo variaram de 70% a 130%, com todos os CVs <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra básica | / | / | / | / | / | / |
| Alta Proteína | 3 pg/μL | 2,65 | 2,80 | 2,73 | 3,80% | 90,87% |
| Alto Ácido Nuclear | 2,82 | 2,97 | 2,90 | 3,71% | 96,58% | |
| Alto teor de sal | 2,88 | 2,70 | 2,79 | 4,47% | 92,89% | |
| pH alto | 2,81 | 2,93 | 2,87 | 2,98% | 95,71% | |
| pH baixo | 2.76 | 2,79 | 2,77 | 0,99% | 92,48% |
Tabela 2 Recuperação de picos de amostra básica
3.3 Precisão
3.3.1 Repetibilidade
Repita o ensaio 10 vezes para padrões de DNA HEK293 a uma concentração de 30 fg/μL com um CV <15%.
| Repetições | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | CV% |
| Valor de detecção (fg/μL) | 29,51 | 30.02 | 30.13 | 30.16 | 27,99 | 31.01 | 31.05 | 30,95 | 31.02 | 29,86 | 30.17 | 3,15% |
Tabela 3 Resultados de repetibilidade
3.3.2 Precisão intermediária
Três experimentadores testaram independentemente amostras padrão de DNA HEK293 em altas e baixas concentrações: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL, e três repetições foram feitas para cada concentração, e os CVs de todos os nove dados obtidos foram <15%.
| Exp |
Concentração real Concentração Teórica | HEK293 ADN (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 30 fg/uL | ||
| Exp 1 | Determinação 1 | 319,58 | 3.026 | 32.02 |
| Determinação 2 | 309,76 | 3.051 | 37.01 | |
| Determinação 3 | 309,24 | 3.067 | 36.03 | |
| Exp 2 | Determinação 4 | 308,34 | 2.909 | 29,91 |
| Determinação 5 | 308,54 | 2.9 | 29,67 | |
| Determinação 6 | 305,83 | 2.921 | 28.85 | |
| Exp 3 | Determinação 7 | 299,11 | 3.035 | 29,36 |
| Determinação 8 | 300,07 | 2.833 | 31.14 | |
| Determinação 9 | 302.03 | 3.033 | 33.07 | |
| / | Significar | 306,95 | 2.975 | 31,90 |
| / | CV% | 2,03% | 2,83% | 9,26% |
Tabela 4 Precisão intermediária Resultados
3.4 Especificidade
A interferência do DNA genômico celular comumente usado na produção de produtos biológicos foi avaliada quanto à interferência com reagentes de detecção de DNA HEK293, e o grupo de interferência se sobrepôs ao grupo de controle e nenhuma interferência foi observada (a figura abaixo mostra, em ordem, os dados de interferência dos DNAs genômicos de CHO, E. coli e Pichia Pastoris com reagentes de detecção de DNA HEK293).
Figura 2 Resultados do experimento de interferência
3.5 Limite de Quantificação
O DNA HEK293 foi detectado em 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL e 5 fg/μL, com 10 réplicas para cada concentração. Os resultados mostraram que o CV foi <20% em concentrações de 10 fg/μL e acima. Ou seja, o limite de quantificação do kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras HEK293 (3G) foi de 10 fg/μL.
|
Repetições Item de teste | HEK293 DNA (3G) (fg/μL) | |
| Quantidade | Taxa de Recálculo% | |
| 1 | 11.04 | 110,40% |
| 2 | 9,97 | 99,70% |
| 3 | 11.12 | 111,20% |
| 4 | 11.07 | 110,70% |
| 5 | 11.21 | 112,10% |
| 6 | 9,93 | 99,30% |
| 7 | 10.25 | 102,50% |
| 8 | 10.16 | 101,60% |
| 9 | 10.08 | 100,80% |
| 10 | 10.11 | 101,10% |
| Significar | 10.49 | / |
| CV% | 5,14% | / |
Figura 3 Resultado do teste qPCR de DNA HEK293 10fg/μL (3G)
3.6 Robustez
Este kit foi testado e é adequado para, mas não limitado a, os seguintes instrumentos:
| Fornecedor | Modelos de Instrumentos | Eficiências de amplificação | R2 | Limite de quantificação (fg/μL) | CV% |
| Termo | ABI 7500 | 102,84% | 1 | 10 | 7% |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 104,70% | 0,999 | 10 | 9% |
| Xangai Hongshi | SLAN | 101,46% | 0,999 | 10 | 8% |
Tabela 5 Resultados dos testes de adequação do instrumento
3.7 Estabilidade
3.7.1 Estabilidade de congelamento e descongelamento
O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras HEK293 (3G) foi testado por congelamento e descongelamento repetidos 10 vezes, e o desempenho do kit não foi afetado.
|
Indicadores de teste Tempos de congelamento e descongelamento | Parâmetro | Tempo T0 | Congelar e descongelar 10 vezes |
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 99,34% | 100,78% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Limite de quantificação (30 fg/μL) | cv | 11% | 7% |
Tabela 6 Análise dos resultados da estabilidade de congelamento e descongelamento
3.7.2 Estabilidade Acelerada
O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras HEK293 (3G) foi armazenado a 2~8°C por 30 dias e 37°C por 14 dias, respectivamente. Nenhum desempenho do kit foi afetado.
|
Indicadores de teste Temperatura e tempo de aceleração | Parâmetro | Tempo T0 | 37℃ 7 dias | 37℃ 14 dias |
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 103,83% | 101,58% | 100,47% |
| R2 | 0,999 | 1 | 1 | |
| Limite de quantificação (30 fg/μL) | CV% | 8% | 5% | 5% |
Tabela 7 Análise dos resultados da estabilidade acelerada
3.8 Limite de Espaço em Branco
Nenhum controle de modelo (NTC) foi uma diluição de modelo com 96 repetições de valores de CT >32 (mais linha de limite de calibração ROX definida como 0,06).
Figura 4 Resultados do experimento NTC
- 4.Referência
4.1 Comissão da Farmacopeia Chinesa (ChPC). Farmacopeia da República Popular da China (Vol Ⅲ) [S]. Pequim: China Medical Science and Technology Press, p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Princípios Gerais para Revisão Técnica de Validação de Métodos Analíticos para Controle de Qualidade de Produtos Biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validação de método analítico Q2》, versão de rascunho.
Informações para pedidos