ศูนย์ประเมินยา (CDE) ของสำนักงานบริหารผลิตภัณฑ์ทางการแพทย์แห่งชาติได้ระบุไว้อย่างชัดเจนในแนวทางสำหรับผลิตภัณฑ์ยีนบำบัดว่าจำเป็นต้องควบคุมปริมาณของสารตกค้างของ DNA และขนาดของชิ้นส่วนสารตกค้าง โดยแนะนำให้ควบคุมขนาดของชิ้นส่วนสารตกค้างของ DNA ให้น้อยกว่า 200 bp ให้ได้มากที่สุด ดังนั้น การกำจัดกรดนิวคลีอิกที่เหลือในผลิตภัณฑ์ชีวเภสัชจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง เนื่องจากกระบวนการผลิตมีความซับซ้อนมากขึ้น การกำจัดกรดนิวคลีอิกที่เหลือในสภาพแวดล้อมที่มีเกลือสูงจึงต้องเผชิญกับความท้าทายใหม่ ๆ มากมาย:
- ในระหว่างกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของไวรัส AAV มักจะใช้บัฟเฟอร์ที่มีความเข้มข้นของเกลือสูงกว่า (200-500 มิลลิโมลาร์) เพื่อปรับปรุงการฟื้นตัวของไวรัส อย่างไรก็ตาม นิวคลีเอสแบบธรรมดาจะแสดงให้เห็นถึงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของกิจกรรมเมื่อความเข้มข้นของเกลือเพิ่มขึ้น หากต้องการปรับปรุงผลการทำให้บริสุทธิ์โดยเพิ่มปริมาณเอนไซม์และเวลาในการฟัก จะทำให้ต้นทุนเพิ่มขึ้นอย่างมาก
- โดยทั่วไปแล้ว DNA ของโฮสต์จะอยู่ในรูปของโครมาตินและถูกห่อหุ้มด้วยโปรตีนได้ง่าย ทำให้เข้าถึง DNA ไม่ได้ ในสภาพแวดล้อมที่มีเกลือสูง กรดนิวคลีอิกและโปรตีนสามารถแยกออกจากกันได้อย่างมีประสิทธิภาพ จึงสามารถกำจัดกรดนิวคลีอิกที่เหลือได้ดีขึ้น
- เวกเตอร์ไวรัส เช่น AAV สามารถรวมตัวกันเนื่องจากปฏิสัมพันธ์ไฟฟ้าสถิตย์ และการรวมตัวนี้มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นภายใต้สภาวะที่มีความแข็งแรงของไอออนต่ำและ DNA ที่เหลืออยู่ ส่งผลให้ความเสถียรลดลงและส่งผลต่อผลผลิต การเพิ่มความเข้มข้นของเกลือสามารถลดการรวมตัวของอนุภาคไวรัส AAV ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งช่วยปรับปรุงอัตราการฟื้นตัวของอนุภาคไวรัส AAV
Salt Active UltraNuclease (salt-tolerant broad-spectrum nuclease) คือเอ็นโดนิวคลีเอสแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากการรวมตัวกันใหม่จากจุลินทรีย์ในทะเล เมื่อเปรียบเทียบกับ UltraNuclease เอ็นโดนิวคลีเอสจะแสดงกิจกรรมที่เหมาะสมที่สุดที่ความเข้มข้นของเกลือ 500 mM และสามารถขจัดการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกได้อย่างมีประสิทธิภาพแม้ในสภาพแวดล้อมที่มีเกลือสูง
สถานการณ์การใช้งานผลิตภัณฑ์
- การกำจัดกรดนิวคลีอิกที่เหลือในผลิตภัณฑ์ชีวภาพ: ในระหว่างการผลิตผลิตภัณฑ์ชีวภาพ เช่น ไวรัส วัคซีน และโปรตีน สามารถเติม UltraNuclease เพื่อย่อยสลายกรดนิวคลีอิกที่เหลือ ขั้นตอนนี้ไม่เพียงแต่เพิ่มผลผลิตของไวรัสเท่านั้น แต่ยังช่วยลดปริมาณกรดนิวคลีอิกที่เหลืออย่างมีนัยสำคัญ จึงรับประกันความปลอดภัยและประสิทธิภาพของยาได้
- การลดความหนืด: การย่อยสลายกรดนิวคลีอิกช่วยลดความหนืดของไลเสทของเซลล์ ซึ่งช่วยให้กระบวนการกรอง/อัลตราฟิลเตรชันเป็นไปได้สะดวกยิ่งขึ้นในระหว่างการทำบริสุทธิ์ของอนุภาคที่ได้จากเซลล์ เช่น ไวรัส เวกเตอร์ AAV และอินคลูชันบอดี
- ความละเอียดและการฟื้นตัวที่ได้รับการปรับปรุง: ในการวิเคราะห์ ELISA, อิเล็กโทรโฟเรซิสสองมิติ และอิเล็กโทรบล็อตด้วยอิมมูโน จะปรับปรุงความละเอียดและการฟื้นตัว
- การป้องกันการรวมตัวของเซลล์: UltraNuclease สามารถป้องกันการรวมตัวของเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลายของมนุษย์ (PBMC) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
การทดสอบประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์
ผลกระทบของสภาพแวดล้อมที่มีเกลือสูงต่อกิจกรรมเอนไซม์ (Na+)
เพื่อให้ตรงกับการใช้ Salt Active UltraNuclease
เพื่อจุดประสงค์นี้
กระบวนการทดลองการตรวจหา Salt Active UltraNuclease ที่เหลือโดยใช้ชุด ELISA Salt Active UltraNuclease
คุณลักษณะของชุดตรวจ ELISA UltraNuclease และ Salt Active UltraNuclease:
การปฏิบัติตามกฎข้อบังคับ: ผ่านการตรวจสอบอย่างสมบูรณ์ตามข้อกำหนดด้านกฎระเบียบ และมีรายงานการตรวจสอบให้พร้อมใช้งาน
การรับรองคุณภาพ: วัตถุดิบทั้งหมดสำหรับชุดได้รับการพัฒนาอย่างอิสระ เพื่อให้แน่ใจว่ามีคุณภาพที่ควบคุมได้
ความไวสูง: ขีดจำกัดเชิงปริมาณต่ำถึง 23 pg/mL
ความแม่นยำสูง: ความสามารถในการทำซ้ำภายในชุดสูงและความแปรปรวนระหว่างชุดต่ำ
ความจำเพาะที่แข็งแกร่ง: ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนเซลล์ที่ออกแบบทางวิศวกรรมอื่น ๆ
พารามิเตอร์ประสิทธิภาพ
| พารามิเตอร์ผลิตภัณฑ์ | เนื้อหา |
| เวลาทดสอบ | 3.5 ชั่วโมง |
| หลักการทดสอบ | การตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันเอนไซม์แบบสองไซต์ |
| การขยายสัญญาณ | ระบบไบโอติน-สเตรปตาติดิน |
| ความยาวคลื่นในการตรวจจับ | 450นาโนเมตรและ 630นาโนเมตร |
| ความไวต่อความรู้สึก | 0.024นาโนกรัม/มล. |
| ระยะการตรวจจับ | 0.047 นาโนกรัม/มล.~3 นาโนกรัม/มล. |
| วัตถุตรวจจับ | เกลือแอคทีฟอัลตร้านิวคลีเอส |
| เครื่องมือที่สามารถนำไปใช้ได้ | อุปกรณ์โมเลกุล: ซีรีส์ M และ i |
| แอปพลิเคชัน | การตรวจจับนิวคลีเอสที่เหลือในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของเซลล์และยีนบำบัดและวัคซีนไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโนรีคอมบิแนนท์ |
ข้อมูลสินค้า :
กราฟมาตรฐานชุดน้ำยา:
ความเฉพาะเจาะจง
ปฏิกิริยาไขว้ระหว่างแอนติบอดี Salt Active UltraNuclease กับโปรตีนทั้งเจ็ดตัวในชุดทดสอบได้รับการประเมินโดยใช้ชุดนี้เพื่อตรวจจับโปรตีนที่เติมลงในกระบวนการทั้งเจ็ดตัว ตั้งค่าการควบคุมเชิงบวก (PC-0.047 ng/mL) และการควบคุมเชิงลบ (NC-0 ng/mL)
ผลการทดลองพบว่าโปรตีนที่เติมลงในกระบวนการทั้ง 7 นั้นใกล้เคียงกับการควบคุมเชิงลบ (NC-0 ng/mL) ความเข้มข้นในการตรวจจับต่ำกว่าขีดจำกัดการวัดปริมาณของชุดนี้ (0.047 ng/mL) และไม่มีปฏิกิริยาไขว้เกิดขึ้น ได้สังเกตแล้ว
สอัตราการฟื้นตัวของหอก:
เพิ่มมาตรฐานความเข้มข้นสามรายการ (เช่น Std1 3 ng/mL, Std3 0.75 ng/mL และ Std5 0.188 ng/mL) ในสัดส่วนที่เท่ากันกับตัวอย่างสองรายการที่ลูกค้าจัดเตรียมไว้สำหรับการทดลองการคืนตัวของสไปก์ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าอัตราการคืนตัวของสไปก์ทั้งหมดอยู่ระหว่าง 80% ถึง 120% อัตราการคืนตัวของสไปก์ % = (ค่าที่วัดได้ของตัวอย่างที่สไปก์ - ค่าที่วัดได้ของตัวอย่างที่ไม่ได้สไปก์) / ค่าทางทฤษฎี (ปริมาณมาตรฐานที่เติมลงไป) * 100%
| ชื่อตัวอย่าง | การทดสอบความเข้มข้นของ Salt Active UltraNuclease（ng/mL） | ปริมาณมาตรฐาน (ng/mL) | ผลการทดสอบ (ng/mL) | อัตราการฟื้นตัวของสไปค์ (%) |
| ทีเอสวัน | 0.04 | 3 | 1.71 | 114.00% |
| 0.75 | 0.347 | 92.53% | ||
| 0.188 | 0.085 | 90.43% | ||
| ทีเอสทู | 0.08 | 3 | 1.772 | 118.13% |
| 0.75 | 0.405 | 108.00% | ||
| 0.188 | 0.104 | 110.64% |
ความแม่นยำ
1) ความสามารถในการทำซ้ำ
เลือกผลิตภัณฑ์มาตรฐาน Salt Active UltraNuclease ที่มีความเข้มข้นสูง ปานกลาง และต่ำ 3 ชนิดสำหรับการทดลองซ้ำ ในการทดลองเดียวกัน ตัวอย่างแต่ละความเข้มข้นจะได้รับการทดสอบ 10 ครั้ง และ CV% < 10%
| ความแตกต่างในแต่ละล็อต | |||
| ความเข้มข้นทางทฤษฎี (นาโนกรัม/มิลลิลิตร) | จำนวนครั้งในการทำซ้ำ | ค่าเฉลี่ย (นาโนกรัม/มล.) | ค่าสัมประสิทธิ์การแปรปรวน CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2.97% |
| 0.188 | 10 | 0.196 | 2.27% |
| 0.047 | 10 | 0.051 | 2.56% |
2) ความแม่นยำระดับกลาง
ใช้ชุดทดสอบชุดต่างๆ สำหรับการทดลอง 3 ครั้ง โดยแต่ละการทดลองใช้ความเข้มข้น 3 ระดับ คือ สูง กลาง และต่ำ และทำซ้ำความเข้มข้นแต่ละระดับ 10 ครั้ง โดยรวมได้ข้อมูลทั้งหมด 30 รายการจากจุดความเข้มข้นแต่ละจุด และ CV% ของความเข้มข้นแต่ละระดับน้อยกว่า 15%
| ความแตกต่างของแบตช์ | |||
| ความเข้มข้นทางทฤษฎี (นาโนกรัม/มิลลิลิตร) | จำนวนการทดลอง | ค่าเฉลี่ย (นาโนกรัม/มล.) | ค่าสัมประสิทธิ์การแปรปรวน CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5.70% |
| 0.188 | 3 | 0.212 | 5.59% |
| 0.047 | 3 | 0.059 | 6.82% |
ข้อมูลสินค้า
| ชื่อสินค้า | ผลิตภัณฑ์ ตัวเลข | ข้อมูลจำเพาะผลิตภัณฑ์ |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96ที |
สินค้าอื่นๆที่เกี่ยวข้อง
| ชื่อสินค้า | หมายเลขสินค้า | ข้อมูลจำเพาะผลิตภัณฑ์ |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36701ES59 | 96ที |