ต้องการควบคุมการเติบโตของเนื้องอกในหนูเปลือยแบบเรียลไทม์หรือไม่? คุณต้องการทราบตำแหน่งของการตั้งรกรากของเซลล์ในหนูหรือไม่? ต้องการทราบผลของการรักษาด้วยยาต่อเนื้องอกหรือไม่ ในร่างกาย? สามารถทำได้โดยติดตั้งตัวติดตามบนเซลล์ ทำให้คุณสามารถควบคุมตำแหน่งและจำนวนเซลล์ได้ตลอดเวลา เทคโนโลยีนี้คือเทคโนโลยี "การตรวจจับ" การถ่ายภาพแบบ in vivo แล้วเทคโนโลยีการถ่ายภาพแบบ in vivo คืออะไร?

1. เทคโนโลยีการถ่ายภาพ in vivo คืออะไร?
2. ลักษณะเฉพาะของการถ่ายภาพด้วยลูซิเฟอเรส
3. ทิศทางการประยุกต์ใช้การถ่ายภาพลูซิเฟอเรส
4. การแบ่งปันตัวอย่างการทดลอง
5. คำถามที่พบบ่อย
6. ข้อมูลสินค้า
7. เรื่องการอ่านหนังสือ

1. เทคโนโลยีการถ่ายภาพ in vivo คืออะไร?

ในช่วงต้นปี 1999 ดร. ไวสส์เลเดอร์แห่งมหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ดในสหรัฐอเมริกาได้เสนอแนวคิดเกี่ยวกับการถ่ายภาพโมเลกุล นั่นคือการใช้เทคนิคการถ่ายภาพเพื่อทำการวิจัยเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณเกี่ยวกับกระบวนการทางชีววิทยาในร่างกายทั้งในระดับเซลล์และโมเลกุล การถ่ายภาพในร่างกายนั้นอาศัยการถ่ายภาพโมเลกุลเป็นหลัก โดยระบบการถ่ายภาพนี้ช่วยให้สามารถสังเกตกระบวนการทางชีววิทยา เช่น การเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของเนื้องอก การพัฒนาของโรคติดเชื้อ และการแสดงออกของยีนเฉพาะในสัตว์ที่มีชีวิตได้

การถ่ายภาพด้วยแสงของสัตว์ที่มีชีวิตนั้นใช้หลักๆ 2 เทคโนโลยี ได้แก่ การเรืองแสงชีวภาพและการเรืองแสง การเรืองแสงชีวภาพคือยีนลูซิเฟอเรสที่ใช้ทำเครื่องหมายเซลล์หรือดีเอ็นเอ ในขณะที่เทคโนโลยีการเรืองแสงใช้ยีนรายงานการเรืองแสง เช่น โปรตีนเรืองแสงสีเขียว และโปรตีนเรืองแสงสีแดง และการเรืองแสง เช่น FITC, Cy5 และ Cy7 องค์ประกอบและจุดควอนตัม (QD) สำหรับการติดฉลาก การเรืองแสงชีวภาพของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยทั่วไปจะรวมยีนลูซิเฟอเรสของหิ่งห้อย (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 554 ตัว ประมาณ 50KD) ซึ่งก็คือยีนลูซิเฟอเรส เข้าไปในดีเอ็นเอของโครโมโซมของเซลล์ที่คาดว่าจะสังเกตเพื่อแสดงลูซิเฟอเรส จากนั้นจึงเพาะเลี้ยงเซลล์สายพันธุ์ที่สามารถแสดงลูซิเฟอเรสได้อย่างเสถียร และเมื่อเซลล์แบ่งตัว แยกแยะ และถ่ายโอน ลูซิเฟอเรสจะยังคงแสดงอย่างเสถียรต่อไป ยีน เซลล์ และสัตว์ที่มีชีวิตทั้งหมดสามารถติดแท็กด้วยยีนลูซิเฟอเรสได้ ลูซิเฟอเรสเป็นเอนไซม์ชนิดหนึ่งที่สามารถเร่งปฏิกิริยาสารตั้งต้นให้เปล่งแสงสีต่างๆ ได้ ลูซิเฟอเรสจากแหล่งต่างๆ มีลักษณะเฉพาะของตัวเองและสามารถเร่งปฏิกิริยาสารตั้งต้นให้เปล่งแสงสีต่างๆ ได้ ลูซิเฟอเรสจากหิ่งห้อยมีความไวสูงและช่วงเชิงเส้นกว้างตั้งแต่ 7~8 ออร์เดอร์ ลูซิเฟอเรสได้กลายเป็นยีนรายงานเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ใช้กันทั่วไปที่สุด พลาสมิดรายงานลูซิเฟอเรสถูกถ่ายโอนเข้าไปในเซลล์ และลูซิเฟอรินซึ่งเป็นสารตั้งต้นจะถูกเติมลงไปเพื่อฟักเซลล์ ในสภาวะที่มี ATP, O₂และไอออนแมกนีเซียม ลูซิเฟอเรสสามารถออกซิไดซ์สารตั้งต้นของลูซิเฟอรินเพื่อสร้างปฏิกิริยาแสงที่มองเห็นได้ ทำให้เกิด "การติดตั้ง 'ตัวติดตาม' ครั้งเดียว และติดตามและตรวจจับได้ตลอดเวลา" นอกจากลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยแล้ว เรนิลลาลูซิเฟอเรสยังถูกนำมาใช้บ้างเช่นกัน สารตั้งต้นของทั้งสองชนิดนั้นแตกต่างกัน โดยสารตั้งต้นของหิ่งห้อยคือ D-luciferin และสารตั้งต้นของเรนิลลาลูซิเฟอเรสคือ coelenterazine ความยาวคลื่นที่เปล่งแสงของทั้งสองชนิดนั้นแตกต่างกัน โดยช่วงความยาวคลื่นแสงที่เปล่งออกมาโดยหิ่งห้อยคือ 540-600 นาโนเมตร และช่วงความยาวคลื่นแสงที่เปล่งออกมาโดยเรนิลลาลูซิเฟอเรสคือ 460-540 นาโนเมตร แสงที่เปล่งออกมาโดยหิ่งห้อยนั้นผ่านเนื้อเยื่อได้ง่ายกว่า ในขณะที่เรนิลลาลูซิเฟอเรสจะถูกเผาผลาญในร่างกายได้เร็วกว่า และความจำเพาะของเรนิลลาลูซิเฟอเรสก็ไม่ดีเท่าเรนิลลาลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยจึงไม่ใช่ยีนรายงานในการทดลองในร่างกายส่วนใหญ่

รูปที่ 1.การแปลตำแหน่งของเซลล์ที่ติดฉลากลูซิเฟอเรส

หลักการทางแสงของการเรืองแสงชีวภาพ: แสงจะกระจัดกระจายและดูดซับเมื่อแพร่กระจายในเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และโฟตอนจะหักเหเมื่อพบกับเยื่อหุ้มเซลล์และไซโทพลาซึม และเซลล์และเนื้อเยื่อแต่ละประเภทจะมีลักษณะการดูดซับโฟตอนที่แตกต่างกัน ฮีโมโกลบินเป็นสาเหตุหลักของการดูดซับแสงที่มองเห็นได้ในร่างกาย และสามารถดูดซับแถบสีน้ำเงิน-เขียวของแสงที่มองเห็นได้ส่วนใหญ่ได้ แต่ในแถบแสงสีแดงของแสงที่มองเห็นได้ที่มากกว่า 600 นาโนเมตร การดูดซับของฮีโมโกลบินจะน้อยมาก ดังนั้น แสงจำนวนมากจึงสามารถผ่านเนื้อเยื่อและผิวหนังเพื่อตรวจจับได้ในบริเวณที่มีสีแดง เทคโนโลยีการถ่ายภาพเรืองแสงชีวภาพของสัตว์มีชีวิตสามารถตรวจจับเซลล์ใต้ผิวหนังได้อย่างน้อยสองสามร้อยเซลล์ อย่างไรก็ตาม จำนวนเซลล์ขั้นต่ำที่สามารถมองเห็นได้จะแตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับความลึกของแหล่งกำเนิดแสงในหนู โดยทั่วไปแล้ว ทุกๆ 1 ซม. ที่เพิ่มขึ้น ความเข้มของแสงจะลดลง 10 เท่า และความเข้มของแสงจะลดลงมากขึ้นสำหรับเนื้อเยื่อและอวัยวะที่มีเลือดมาก และจะลดลงน้อยลงสำหรับเนื้อเยื่อและอวัยวะที่อยู่ติดกับกระดูก ในกรณีที่มีความลึกเท่ากัน ความเข้มของแสงที่ตรวจพบจะมีความสัมพันธ์เชิงเส้นอย่างมีนัยสำคัญกับจำนวนเซลล์ และความเข้มของแสงที่ตรวจพบสามารถวัดได้โดยเครื่องมือเพื่อสะท้อนจำนวนเซลล์

รูปที่ 2 หลักการเรืองแสงของปฏิกิริยาลูซิเฟอเรสและเกลือโพแทสเซียมลูซิเฟอริน

เทคโนโลยีการเรืองแสงแตกต่างจากการเรืองแสงชีวภาพตรงที่ใช้ยีนรายงานการเรืองแสงหรือสีย้อมเรืองแสง (รวมถึงวัสดุติดฉลากนาโนใหม่ เช่น จุดควอนตัมเรืองแสง) สำหรับการติดฉลาก การใช้การเรืองแสงจากยีนรายงาน โปรตีนเรืองแสง หรือสีย้อม สามารถสร้างแหล่งกำเนิดแสงทางชีวภาพในร่างกายได้ การเรืองแสงชีวภาพคือการเรืองแสงอัตโนมัติในสัตว์ที่ไม่มีแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น ในขณะที่การเรืองแสงต้องอาศัยแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นภายนอกก่อนที่ระบบถ่ายภาพจะตรวจพบได้ ฉลากเรืองแสงใช้กันอย่างแพร่หลาย รวมถึงสัตว์ เซลล์ จุลินทรีย์ แอนติบอดี ยา วัสดุนาโน ฯลฯ

2. ลักษณะเฉพาะของการถ่ายภาพด้วยลูซิเฟอเรส

◎ ไม่มีรังสี แทบไม่เป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิต

◎ การเรืองแสงโดยไม่ต้องมีแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น

◎ ความไวสูง สามารถตรวจจับเซลล์ได้หลายร้อยเซลล์

◎ มีความสามารถในการทะลุทะลวงที่ดี โดยยังสามารถตรวจจับความลึกของเนื้อเยื่อ 3-4 ซม. ได้

◎ อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง สัญญาณเรืองแสงที่แข็งแกร่ง และป้องกันสัญญาณรบกวนได้ดี

3. ทิศทางการประยุกต์ใช้การถ่ายภาพลูซิเฟอเรส

3.1 การเจริญเติบโตของเนื้องอก

ในการทดลองการเกิดเนื้องอกในหนูเปลือย การเจริญเติบโตของเนื้องอกถูกสังเกตแบบเรียลไทม์โดยไม่มีการบุกรุก และไม่จำเป็นต้องแยกเนื้องอกออกเพื่อการวัด

3.2 ยารักษาโรคมะเร็ง

ตรวจพบอิทธิพลของการบริหารต่อการเจริญเติบโตของเนื้องอกหรือการแพร่กระจาย และสามารถกำจัดสารตั้งต้นฟลูออเรสซีนได้ภายใน 3 ชั่วโมง โดยไม่รบกวนการทดลองยา

3.3 การระบุตำแหน่งเซลล์

ตรวจพบตำแหน่งและการกระจายตัวของเซลล์แปลกปลอมในสัตว์

3.4 การควบคุมการแสดงออกของยีน

ยีนเป้าหมายหรือโปรโมเตอร์ของยีนเป้าหมายถูกหลอมรวมกับยีนลูซิเฟอเรสเพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนในระหว่างการรักษาด้วยยาหรือการดำเนินของโรค

3.5 การวิจัยเซลล์ต้นกำเนิด

การติดตามการปลูกถ่าย การอยู่รอด และการแพร่กระจายของเซลล์ต้นกำเนิด การติดตามการกระจายและการอพยพของเซลล์ต้นกำเนิด ในร่างกาย-

4. การทดลอง ตัวอย่าง การแบ่งปัน

รูปที่ 3. ในร่างกาย การตรวจจับภาพเพื่อผลการรักษาของ CAR-MUC1 ที/คาร์-MUC1-IL22 เซลล์ T ในการสร้างเนื้องอกโดยการฉีดเซลล์ HN4 เข้าใต้ผิวหนัง หนู^[1]-

รูปที่ 4 หลังจากฉีดเซลล์ HUC-MSC เข้าไปในกล้ามเนื้อโครงร่างของหนูแล้ว จะสามารถตรวจพบตำแหน่งของเซลล์ได้โดย ในร่างกาย การถ่ายภาพ (ทำเครื่องหมายด้วยลูกศรสีแดง)^[2]-

รูปที่ 5. ความสามารถของ ในร่างกาย การถ่ายภาพเพื่อตรวจจับการเคลื่อนที่ของเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (MSC) ไปยังบริเวณที่ถูกไฟไหม้ เซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (MSC/FLuc) ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำในหนูทดลองที่ถูกไฟไหม้ สี่วันหลังจากการฉีด สัญญาณการเรืองแสงจะปรากฏขึ้นที่บริเวณที่ได้รับบาดเจ็บจากแผลไฟไหม้ จากนั้นจึงค่อยๆ ลดลง (ลูกศรสีแดงระบุบริเวณที่ถูกไฟไหม้)^[3]-

5. คำถามที่พบบ่อย

คำถามที่ 1: เมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยีแบบดั้งเดิม เทคโนโลยีถ่ายภาพเรืองแสงชีวภาพมีข้อได้เปรียบอะไรบ้าง

เมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยีดั้งเดิมแล้ว เทคโนโลยีนี้มีความละเอียดอ่อนกว่าวิธีการดั้งเดิมในการวิจัยการแพร่กระจายของเนื้องอก การบำบัดด้วยยีน ระบาดวิทยา การติดตามเซลล์ต้นกำเนิด มะเร็งเม็ดเลือดขาว และการวิจัยที่เกี่ยวข้องอื่นๆ นอกจากนี้ เทคโนโลยียังสามารถศึกษาการเกิดโรคและการคัดกรองยาสำหรับโรคที่เกี่ยวข้องได้อย่างรวดเร็วและชัดเจนผ่านแบบจำลองโรคสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมชุดหนึ่ง

คำถามที่ 2: จะติดฉลากเซลล์ต้นกำเนิดด้วยยีนลูซิเฟอเรสได้อย่างไร

ยีนที่แสดงออกอย่างต่อเนื่องสามารถติดฉลากเพื่อสร้างหนูทรานส์เจนิก และเซลล์ต้นกำเนิดก็ได้รับการติดฉลาก เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดจะถูกนำมาจากไขกระดูกของหนูและปลูกถ่ายเข้าไปในไขกระดูกของหนูตัวอื่น เทคโนโลยีนี้สามารถใช้เพื่อติดตามการแพร่กระจาย การแยกตัว และการอพยพของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดในร่างกาย อีกวิธีหนึ่งคือการติดฉลากเซลล์ต้นกำเนิดด้วยเลนติไวรัส

คำถามที่ 3: ควรทดสอบหลังจากฉีดฟลูออเรสซีนนานแค่ไหน และการเรืองแสงคงอยู่ได้นานแค่ไหน?

โดยทั่วไปสัญญาณการเรืองแสงจะถึงช่วงที่เสถียรที่สุดหลังจากฉีดเข้าช่องท้องเป็นเวลา 10-15 นาที และเริ่มสลายตัวหลังจาก 20-30 นาที หลังจาก 3 ชั่วโมง ฟลูออเรสซีนจะถูกกำจัดและการเรืองแสงจะหายไปอย่างสมบูรณ์

Q4: ฉีดฟลูออเรสซีนให้หนูอย่างไร? วิธีฉีดแตกต่างกันอย่างไร?

สามารถฉีดฟลูออเรสซีนเข้าไปในหนูได้โดยการฉีดเข้าช่องท้องหรือฉีดเข้าเส้นเลือดที่หาง ฟลูออเรสซีนสามารถแพร่กระจายไปทั่วร่างกายของหนูได้ภายในเวลาประมาณ 1 นาที ในกรณีส่วนใหญ่ ความเข้มข้นของฟลูออเรสซีนอยู่ที่ 150 มก./กก. สำหรับหนูน้ำหนัก 20 กรัม สามารถใช้ฟลูออเรสซีนได้ประมาณ 3 มก. สำหรับการฉีดเข้าช่องท้อง การแพร่กระจายจะช้า การเรืองแสงในช่วงแรกจะช้า และเวลาการเรืองแสงต่อเนื่องจะนาน สำหรับการฉีดฟลูออเรสซีนเข้าเส้นเลือดที่หาง ฟลูออเรสซีนจะแพร่กระจายอย่างรวดเร็วและเริ่มเปล่งแสงอย่างรวดเร็ว แต่ระยะเวลาการเรืองแสงจะสั้น

6.ข้อมูลสินค้า

Yeasen เป็นบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพที่ดำเนินการวิจัย พัฒนา ผลิต และจำหน่ายรีเอเจนต์ชีวภาพหลัก 3 ชนิด ได้แก่ โมเลกุล โปรตีน และเซลล์ ผลิตภัณฑ์ที่จัดทำโดย Yeasen มีดังนี้.

ตารางที่ 1 ข้อมูลสินค้า

7. เรื่องการอ่านหนังสือ

ระบบตรวจจับยีนรายงานลูซิเฟอเรสรุ่นใหม่——ง่ายขึ้น ไวขึ้น แม่นยำขึ้น