Sonda de depleção de mRNA de globina (humana) é projetado para remover o mRNA da Globina humana. Ele pode remover efetivamente o mRNA da Globina de adultos, bebês e embriõeslegal fontes, incluindo HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 e HBZ. Este produto é usado com Hieff NGS^TM MaxUp rRNA Depletion Kit (Humano/Camundongo/Rato) (Yeasen#12253) para remover efetivamente rRNA e Globin mRNA do RNA total. Este kit é adequado para amostras de RNA intactas e degradadas. As amostras de RNA após a remoção de rRNA e Globin mRNA podem ser usadas para análise de sequenciamento de alto rendimento de mRNA e RNA não codificador, o que aumenta significativamente a proporção de dados válidos em resultados de sequenciamento e síntese de cDNA ou outras aplicações downstream.

Aplicação do produto

Adequado para amostras de RNA total de 100 ng ~ 1 μg humano, recursos de sangue de camundongos e ratos, e para amostras de RNA intactas ou parcialmente degradadas.

Componentes do produto

Envio e armazenamento

Todos os componentes são enviados com gelo seco e podem ser armazenados a -20°C por um ano.

Figura

Um total de 500ng e 100ng de RNA total de sangue humano passou por remoção de rRNA e remoção combinada de rRNA e Globina, respectivamente. Após a construção da biblioteca e sequenciamento, o conteúdo de mRNA de Globina foi comparado.

Cuidados

1. Por favor, use consumíveis livres de contaminação por RNase e limpe a área experimental regularmente. É recomendado usar o RNAZap da ThermoFisher^TM spray de remoção de ácido nucleico de alta eficiência para remover contaminação por RNase.

2. A amostra de RNA deve estar livre de contaminação de DNA genômico. Se o gDNA permanecer na amostra, ele deve ser digerido pela DNase I e purificado antes do uso.

3. O volume máximo de entrada da amostra de RNA é de 10 μL. Se o volume da amostra for grande, ela pode ser concentrada primeiro.

4. Para sua segurança e saúde, use jalecos e luvas descartáveis ​​durante a operação.

5. Somente para uso em pesquisa!

Instruções

1. Hibridização da sonda com RNA

1.1 Diluir 10 ng–1 μg de RNA total com Nuclease-free Water para um volume final de 10 μL em um tubo de PCR. Manter o RNA no gelo.

1.2 Montar a seguinte reação de hibridização RNA/sonda no gelo conforme Tabela 1.

Tabela 1 Reação de hibridização RNA/sonda

1.3 Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga para coletar o líquido da lateral do tubo.

1.4 Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte programa na Tabela 2 com a tampa aquecida ajustada para 105°C.

Tabela 2 Programa de reação de hibridização RNA/sonda

2. Digestão da RNase H

2.1 Monte a seguinte reação de digestão da RNase H no gelo conforme Tabela 3.

Tabela 3 Reação de digestão da RNase H

2.2 Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga para coletar o líquido da lateral do tubo.

2.3 Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte programa: tampa 50°C; 37°C, 30 min; 4°C, espere.

3. DNAse EU Digestão

3.1 Monte a seguinte reação de digestão da DNase I no gelo de acordo com a Tabela 4.

Tabela 4 Reação de digestão da DNase I

3.2 Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Gire brevemente o tubo em uma microcentrífuga para coletar o líquido da lateral do tubo.

3.3 Coloque o tubo em um termociclador e execute o seguinte programa: tampa aberta; 37°C, 30 min; 4°C, espere.

4. Purificação de RNA

4.1 Equilibre o Hieff NGS^TMRNA Cleaner (Cat#12602) à temperatura ambiente e ressuspenda as esferas completamente agitando-as antes de usar.

4.2 Adicionar 110 µL (2,2×) contas à solução de RNA da Etapa 3.3 e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

4.3 Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para ligar o RNA às esferas.

4.4 Coloque o tubo em um suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante. Quando a solução estiver límpida (cerca de 3 min), descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não tocar nas esferas com as pontas da pipeta.

4.5 Mantenha o tubo no suporte magnético. Adicione 200 µL de etanol 80% recém-preparado ao tubo. Incube em temperatura ambiente por 30 segundos e então descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não tocar nas esferas com as pontas da pipeta.

4.6 Repita a Etapa 4.5 uma vez para um total de duas lavagens.

4.7 Remova o etanol residual com 10 µL - pontas de pipeta. Mantenha o tubo no suporte magnético e deixe as contas secarem ao ar por até 5 minutos com a tampa aberta.

4.8 Remova o tubo do suporte magnético. Elua o RNA das esferas adicionando 11 μL de Nuclease-free Water. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes e gire brevemente o tubo.

4.9 Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo no suporte magnético até que a solução fique límpida (~ 3 minutos).

4.10 Transfira 10 µL do sobrenadante para um tubo livre de nuclease.

Observação: se você precisar parar neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a –80°C.