차세대 시퀀싱(NGS)은 유전자 발현 연구 방식을 혁신했으며, mRNA 시퀀싱(mRNA-Seq)은 전사체 연구의 초석이 되었습니다. NGS를 처음 접하는 분이든, 워크플로우를 개선하고 싶은 분이든, 이 가이드는 mRNA 라이브러리 준비의 모든 단계를 안내합니다. 정제 단계부터 피해야 할 흔한 함정까지 모든 과정을 안내합니다.
mRNA-Seq란 무엇이고 왜 중요한가?
mRNA-Seq는 연구자들이 전사체를 포착하여 유전자 발현, 선택적 스플라이싱, 그리고 새로운 전사체 발견에 대한 통찰력을 제공할 수 있도록 지원합니다. mRNA-Seq는 암 연구, 발생 생물학, 그리고 개인 맞춤 의학 분야에서 강력한 도구로 활용됩니다.
1 단계 : mRNA 정제
mRNA를 정제하는 이유는?
총 RNA에는 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA), 그리고 기타 비암호화 RNA가 포함됩니다. 정확한 mRNA-Seq를 위해서는 일반적으로 다음과 같은 방법으로 mRNA를 증폭해야 합니다.
- Oligo(dT) 자기 비드: mRNA의 폴리-A 꼬리를 포착합니다.
- rRNA 고갈 키트: 분해된 샘플이나 폴리아데닐화된 mRNA가 없는 종에 유용합니다.
그림 1. 인체 조직이나 세포에서 추출한 총 RNA 중 다양한 RNA 유형의 분포를 보여주는 원형 차트입니다.
폴리(A) 정제: 진핵생물 mRNA 농축을 위한 핵심 단계
대부분의 진핵생물 mRNA는 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 가지고 있는데, 이는 원핵생물 mRNA와 다른 점입니다. 이 폴리(A) 꼬리 덕분에 mRNA를 쉽고 선택적으로 정제할 수 있습니다.
가장 일반적인 방법은 Oligo(dT) 자성 비드를 사용하여 총 RNA에서 mRNA를 특이적으로 결합하고 포획하는 것입니다(그림 2 참조). 이 방법은 간단하고 효율적이며 널리 사용됩니다.
또 다른 방법은 역전사 과정에서 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 mRNA를 표적화하는 것입니다. 그러나 이 방법은 특이성이 떨어지고 효율도 낮기 때문에 대부분의 경우 자성 비드 기반 정제가 선호됩니다.
그림 2. Oligo(dT) 자기 비드는 진핵생물 mRNA의 폴리(A) 꼬리에 특이적으로 결합합니다.
rRNA 제거 방법: Poly(A) 선택이 불가능한 경우
원핵생물 RNA나 분해된 총 RNA(예: FFPE 샘플)처럼 폴리(A) 꼬리가 없는 샘플의 경우, 폴리(A) 기반 농축은 불가능합니다. 이러한 경우에는 rRNA 제거를 통해 mRNA를 농축합니다.
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범주 |
프로브 하이브리디제이션(Ribo-Zero) |
RNase H 소화 ( 가장 일반적으로 사용되는 ) |
원스텝 rRNA 차단제(RT 차단제) |
자기 비드 기반 rRNA 제거 |
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원칙 |
종 특이적 프로브는 rRNA와 교잡되어 스트렙타비딘 비드를 통해 제거됩니다. |
DNA 프로브 + RNase H는 DNA-RNA 하이브리드에서 rRNA를 소화합니다. |
차단 프로브는 rRNA의 역전사를 방지합니다. |
바이오틴 프로브는 rRNA에 교잡되어 자기 비드를 통해 제거됩니다. |
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장점 |
효율성이 높고 특이성이 좋으며 종을 초월하여 작용합니다. |
특이성이 높고 효율적이며 종을 초월하여 작동합니다. |
빠르고(3분), 간단한 단일 단계, 정제 불필요, 높은 검출력. |
효율성이 높고, 종간 호환성이 넓으며, 특이성이 높습니다. |
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제한 사항 |
종별 프로브가 필요합니다. |
종 특이적 DNA 프로브가 필요합니다. |
특수 키트가 필요합니다. |
비용이 더 많이 듭니다. |
그림 3. rRNA 제거의 개략도
2단계: mRNA 단편화 전략
mRNA 정제 후 NGS 라이브러리를 구축하기 위한 두 가지 주요 전략이 있습니다.
1) 역전사 먼저, cDNA 조각화 나중에:
mRNA는 먼저 Oligo(dT) 프라이머를 사용하여 역전사되어 긴 cDNA를 생성합니다. 그 후, cDNA는 이중 가닥 cDNA(dsDNA)로 변환되고 효소 분해 또는 기계적 전단을 통해 단편화됩니다. 이후 라이브러리 제작은 표준 DNA 라이브러리 워크플로우를 따릅니다.
2) mRNA 단편화가 먼저, 역전사가 나중에:
mRNA는 알칼리 처리, 금속 이온 처리(Mg²⁺ 또는 Zn²⁺), 또는 효소 분해(예: RNase III)와 같은 방법을 사용하여 먼저 단편화됩니다. 단편화 후, RNA 분해를 방지하기 위해 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 즉시 수행해야 합니다.
금속 이온 단편화의 경우, 원하는 단편 크기에 따라 조건을 조정할 수 있습니다.
- 150–200 bp: 94°C, 15분
- 200–300 bp: 94°C, 10분
- 250–550 bp: 94°C, 5분
이 두 가지 접근 방식은 서로 다른 전사본 범위 선호도를 초래합니다. 자세한 내용은 아래 그림을 참조하세요.
그림 4. 다양한 라이브러리 준비 방법에 따른 전사본 적용 편향.
붉은색 선은 역전사 전 RNA 단편화를 나타내고, 녹색 선은 역전사 후 cDNA 단편화를 나타냅니다.
역전사 전 mRNA를 단편화하면 주로 유전자 본체를 고르게 포함하는 시퀀싱 리드가 생성됩니다. 반면, Oligo(dT) 프라이머를 사용한 역전사는 전사체의 3' 말단에 편향된 리드를 생성하는 경향이 있습니다. 따라서 mRNA-Seq의 경우, 일반적으로 mRNA를 먼저 단편화한 후 역전사를 수행하여 전사체 커버리지를 더욱 균일하게 확보하는 것이 권장됩니다.
3단계: 이중 가닥 cDNA 합성
mRNA 라이브러리 구축에는 표준 라이브러리(비-가닥 특이적)와 가닥 특이적 라이브러리, 두 가지 주요 유형의 라이브러리가 있습니다. 주요 차이점은 두 번째 가닥 cDNA 합성에 사용되는 뉴클레오티드에 있습니다.
- 표준 라이브러리의 경우 일반 dNTP가 사용됩니다.
- 가닥 특이적 라이브러리의 경우, 두 번째 가닥 합성 과정에서 dNTP 혼합물에서 dUTP가 dTTP를 대체합니다. 이를 통해 우라실이 두 번째 가닥에 결합됩니다.
나중에 우라실을 포함하는 가닥을 선택적으로 제거하여 가닥 특이성을 확보할 수 있습니다. 이는 일반적으로 다음과 같은 방법으로 수행됩니다.
- 우라실을 포함하는 가닥의 증폭을 차단하는 효소를 사용하거나
- 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 처리하여 우라실을 함유하는 가닥을 분해합니다.
성공적인 mRNA 라이브러리 준비를 위한 중요한 팁
mRNA 라이브러리 준비 과정에서 흔히 저지르는 실수를 피하는 데 도움이 되는 몇 가지 유용한 팁을 소개합니다.
팁 1: mRNA 라이브러리 준비에는 높은 RNA 무결성이 요구됩니다. 대부분 온전한 mRNA만이 신뢰할 수 있는 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다.
팁 2: 폴리(A) 자성 비드를 정제할 때, 비드가 3' 폴리(A) 꼬리 근처의 서열을 포획한다는 점을 기억하십시오. mRNA가 분해되면 5' 말단을 포함하는 단편은 포획되지 않고 세척 과정에서 손실됩니다(그림 8 참조). 이로 인해 3' 말단에 유리한 편향된 데이터가 생성됩니다.
팁 3: 가능한 한 완전한 mRNA 분자의 시퀀싱을 보장하려면 라이브러리를 준비하기 전에 RNA 품질 관리를 수행하세요.
Agilent Bioanalyzer 2100과 같은 장비를 사용하여 18S 및 28S rRNA 피크를 분석하여 RNA 무결성을 평가하십시오. 날카롭고 높은 피크는 분해가 적고 무결성이 높음을 나타냅니다.
이 기기는 RNA 무결성 지수(RIN)를 0(분해됨)에서 10(무손상)까지 표시합니다. 최상의 결과를 얻으려면 RIN ≥ 8.0인 RNA 샘플을 사용하십시오.
제품 목록
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범주 |
이름 |
카탈로그 번호 |
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RNA 라이브러리 준비 |
듀얼 모드(스트랜드 특정 및 스트랜드 비특정) |
12308ES |
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프리믹스 버전 |
12340ES |
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12341ES |
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mRNA 분리 |
진핵생물 mRNA |
12629ES |
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rRNA 고갈 |
인간/쥐/래트 |
12257ES |
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인간/쥐/래트 |
12254ES |
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12602ES |
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