소중한 라이브러리 준비를 마치고 시퀀싱에 보냈는데... 악몽이 찾아왔습니다. QC 보고서에 "실패"라고 적혀 있었죠. 무슨 일이 있었던 걸까요? 넓은 피크, 지저분한 피크, 짧은 단편, 얼룩, 어댑터 다이머, 오염, 아니면 단순히 농도 부족일까요?
그렇다면 고품질 시퀀싱 라이브러리는 어떤 모습일까요? 그리고 더 중요한 것은, 라이브러리 성공률을 어떻게 향상시킬 수 있을까요?
도서관 QC 101: 정말 중요한 것은 무엇인가?
도서관 품질 관리에는 두 가지 주요 체크포인트가 있습니다.
1. 도서관 집중도
이는 일반적으로 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료를 사용하는 Qubit dsDNA 분석법을 사용하여 측정합니다. 이 염료는 표적 분자에 결합했을 때만 형광을 방출하여 매우 정확한 정량 결과를 제공합니다.
✅ 대부분의 시퀀싱 플랫폼에는 다음이 필요합니다. 라이브러리 농도 ≥ 2 ng/μL
하지만 주의하세요. 농도 테스트를 통과했다고 해서 라이브러리가 시퀀싱에 적합하다는 의미는 아닙니다. 크기 분포가 맞지 않으면 실제로 사용 가능한 라이브러리 농도는 보고된 것보다 훨씬 낮을 수 있습니다.
2. 도서관 규모 분포
여기서 가장 일반적으로 사용되는 도구는 미세유체 모세관 전기영동을 활용하는 Agilent Bioanalyzer입니다.
작동 원리는 다음과 같습니다.
- 전압을 가하면 샘플이 작은 에칭 마이크로채널을 통해 이동합니다.
- DNA 조각은 이동하면서 크기에 따라 분리됩니다.
- 형광염료는 이중가닥 DNA에 결합하고 레이저에 의해 자극되어 감지 가능한 신호를 생성합니다.
- 그 결과, DNA 조각 크기 분포를 보여주는 전기영동도가 탄생했는데, 이는 도서관의 지문과도 같습니다.
몰 농도는 다음을 사용하여 추정하는 경우가 많습니다.
라이브러리 몰 농도(pmol) ≈ 질량(ng) / [0.66 × 평균 단편 크기(bp)]
✅ "좋은" 도서관은 어떤 모습일까요?
PE150 시퀀싱(페어드 엔드 150 bp)의 경우 고품질 라이브러리는 다음 기준을 충족해야 합니다.
- 300~600bp 사이의 주요 피크
- 정규 분포와 유사한 매끄럽고 종 모양의 곡선
- 눈에 보이는 어댑터 다이머나 프라이머 다이머 피크가 없습니다.
- 최소 배경 소음 또는 2차 피크
그림 1. 적격 시퀀싱 라이브러리의 대표적 전기영동도
어댑터 다이머, 번짐, 그리고 미스터리 피크? 전기영동도가 알려주는 것들
방금 라이브러리 QC를 완료했는데, 전기영동도가... 의심스럽습니다. 있어야 할 곳에 작은 봉우리가 있거나, 너무 넓게 퍼져 있는 크고 두꺼운 융기부가 있거나, 심지어 오염을 시사하는 여러 개의 봉우리가 있습니다. 가장 흔한 라이브러리 QC 실패 사례와 그 원인, 그리고 가장 중요한 해결 방법을 살펴보겠습니다.
1. 어댑터 오염/단편 단편 오염(15–270 bp)
이것이 라이브러리가 QC에 실패하는 가장 흔한 이유입니다. 잔류 어댑터나 짧은 단편은 시퀀싱 과정에서 우선적으로 뭉쳐져 유동 셀의 귀중한 공간을 차지합니다. 결과적으로 전체 수율이 낮아지고 사용 가능한 데이터도 줄어듭니다.
짧은 단편 영역이 전체 라이브러리 피크의 3%를 초과하면 라이브러리가 거부될 수 있습니다.
가능한 원인:
저하된 샘플 – 단편화되거나 흐릿한 입력으로 인해 짧은 정크 데이터가 늘어납니다.
→ 새로운 샘플을 사용하고 분할 조건을 최적화합니다.
부적절한 구슬 선택 비율 – 크기 선택이 핵심입니다.
→ 원치 않는 조각을 더 잘 제외하기 위해 정리 비율을 조정합니다.
과도한 어댑터 추가 - 어댑터에 과부하가 걸리면 정화 효율이 떨어집니다.
→ 남은 다이머를 피하기 위해 입력량에 따라 어댑터를 희석하세요.
그림 2. 어댑터 다이머 및 짧은 단편으로 인한 라이브러리 오염
2. 트레일링 피크: 라이브러리가 제대로 줄어들지 않을 때
전기영동도에서 문제가 있는 라이브러리의 가장 흔한 징후 중 하나는 "테일링"입니다. 즉, 주요 피크가 기준선으로 깨끗하게 돌아오지 않고 한쪽이 비대칭적이거나 번져 보이는 것입니다.
후행 영역이 전체 분포의 40% 이상을 차지하는 경우 라이브러리는 후행 문제가 있는 것으로 표시되고 QC에 실패한 것으로 간주될 수 있습니다.
꼬리 끌림의 가능한 원인:
1) 부적절한 젤 절제 범위
겔 기반 크기 선택을 사용하는 경우 너무 넓거나 대상에서 벗어난 조각 범위를 선택하면 원치 않는 크기 캐리오버가 발생할 수 있습니다.
2) 반응 혼합물의 높은 염 농도
추출이나 정제 과정에서 잔류하는 염은 중합효소 성능에 영향을 미치고 조각 품질 문제를 일으킬 수 있습니다.
→ 라이브러리 준비 전에 추가적인 핵산 정제 단계를 고려하세요.
3) PCR 중 과증폭
사이클이 너무 많거나 프라이머가 부족하면 비특이적 증폭이 발생하여 수율이 낮아지고 피크가 흐릿해질 수 있습니다.
→ 프라이머 농도를 최적화하고 과도한 PCR 사이클링을 피하세요.
그림 3 테일링 라이브러리 프로필을 보여주는 전기영동도
3. 넓은 피크 = 단편화 문제
라이브러리가 "통통해" 보이고, 피크가 예상 크기 범위를 벗어나 시작해서 끝나는 경우, 이는 단편화 문제일 가능성이 높습니다. 이상적으로는 피크가 300~600bp(PE150의 경우) 사이에 조밀하고 중앙에 위치해야 합니다.
가능한 원인:
최적이 아닌 단편화 조건 – 너무 뜨겁거나, 너무 길거나, 효소가 너무 많습니다.
→ 대상 크기에 맞게 조각화 설정을 조정하세요.
잘못된 비드 청소 비율 –
→ 피크를 조여주기 위해 사이즈 선택 프로토콜을 보정하세요.
낮은 품질의 DNA/RNA 입력 – 젤에 분해 또는 번진 밴드가 나타남.
→ 손상되지 않은 고품질의 원료를 사용하세요.
그림 4. 비정상 조각 분포: Broad Peak
4. 다중 피크/미스터리 피크(더블 피크 또는 비타겟 피크)
전기영동도에서 피크가 두 개 이상 나타나는 경우(특히 비대상 단편 크기) 오염이 있거나 크기 선택이 잘못되었을 가능성이 있습니다.
가능한 원인:
샘플 교차 오염 – 공유 팁, 튜브 또는 피펫팅 오류로 인해 발생합니다.
→ 실험실 관행을 확인하고 샘플 사이에 팁을 바꾸세요.
부적절한 사이즈 선택 –
→ 청소 조건이 좋지 않으면 크고 작은 파편이 몰래 들어올 수 있습니다.
그림 5 비정상 라이브러리 프로필: 혼합 피크
이 모든 걸 피하는 방법? 더 나은 키트부터 시작하세요.
이러한 문제 중 다수는 다음에서 비롯됩니다.
- 품질이 낮거나 분해된 DNA/RNA
- 일관되지 않은 단편화
- 비효율적인 어댑터 결찰
- 불충분한 정화
그렇기 때문에 견고하고 최적화된 라이브러리 준비 키트를 선택하는 것이 매우 중요합니다.
✅ Yeasen의 12927 및 12972 시리즈와 같은 고품질 DNA 및 RNA 라이브러리 준비 키트는 일반적인 실패 지점을 최소화하고 Bioanalyzer에서 예상치 못한 일이 줄어들면서 원활하고 대칭적이며 고수율의 라이브러리를 제공하도록 설계되었습니다.
네 봉우리가 깨끗하고 네 송이가 많기를
QC의 어려움은 현실이지만, 해결 가능합니다. 적절한 프로토콜, 적절한 관리, 그리고 고성능 시약을 사용하면 라이브러리를 시퀀싱에 자신 있게 대비할 수 있습니다.
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범주 |
이름 |
카탈로그 번호 |
메모 |
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DNA 라이브러리 준비 키트 |
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12972ES |
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RNA 라이브러리 준비 키트 |
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스트랜드 특정 및 비스트랜드 특정 |
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가닥 특정 |
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스트랜드 특정 아님 |
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식물 |
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12629ES |
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