급속한 기술 발전 시대에 DNA 세계의 해독기 역할을 하는 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리 제작 기술은 점점 더 중요한 역할을 하고 있습니다. 이 기술은 암 유전자 검출, 유전 질환 스크리닝, 마이크로바이옴 연구 등의 분야에서 상당한 가치를 입증하며 과학 연구와 임상 의학에 혁명적인 변화를 주도하고 있습니다.
NGS 워크플로우는 핵산 추출 → 라이브러리 제작 → 표적 포착 → 시퀀싱 → 생물정보학적 분석의 순으로 진행됩니다. 라이브러리 제작 기술의 핵심은 표적 DNA/RNA 분자를 고처리량 시퀀싱 장비와 호환되는 라이브러리로 변환하여 중요한 생물학적 정보가 포함된 시퀀스 데이터를 확보하는 것입니다.
그림 1: NGS 워크플로
DNA 라이브러리 구축을 예로 들어 보겠습니다. 작업 흐름은 다음과 같습니다. DNA 단편화 → 말단 복구 및 A-꼬리 제거 → 어댑터 연결 → 정제 및 분류 → 라이브러리 증폭 → 라이브러리 정제 .
그림 2: DNA 라이브러리 구축 워크플로
DNA 단편화
현재 NGS 플랫폼의 판독 범위가 제한적 이기 때문에 추출된 DNA 샘플은 단편화가 필요합니다. 이는 일반적으로 효소 또는 기계적 방법을 통해 이루어집니다.
- 기계적 분열: 라이브러리 준비 시 단편화의 황금 표준으로 간주되는 엄격한 크기 분포와 최소한의 서열 편향을 갖는 DNA 단편을 생성하지만, 비용이 약간 더 높습니다.
- 효소적 단편화: 서열에 구애받지 않는 단편화 효소를 활용하여 복잡한 기계적 장비 없이도 안정적인 단편화 결과를 제공합니다. 생성된 단편의 크기는 효소 분해 시간에 따라 결정됩니다.
다양한 단편화 효소가 존재하지만, 대부분은 엔도뉴클레아제 원리에 따라 작동한다는 점은 주목할 만합니다. 이 중 Tn5 트랜스포사제는 초고속 라이브러리 구축 능력으로 NGS 시장에서 여전히 우위를 점하고 있지만, 고유한 서열 편향으로 인해 적용 범위가 제한적입니다. DNase I, Endonuclease V, 그리고 Fragmentase (효소 혼합물)와 같은 효소는 유망하지만, 광범위한 적용을 가로막는 한계에 직면해 있습니다. Fragmentase는 현재 NGS에서 가장 널리 인정받는 효소 단편화 방법입니다.
표 1: 다양한 단편화 효소의 원리 및 한계
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효소 클래스 |
DNA 분해 효소 1 |
엔도뉴클레아제 V |
프래그멘타제 |
티엔5 |
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구성 |
단일 효소 |
단일 효소 |
효소 혼합물 |
단일 효소 |
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유형 |
엔도뉴클레아제 |
엔도뉴클레아제 |
엔도뉴클레아제 |
트랜스포사제 |
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원칙 |
다양한 양이온 조건에서 DNA를 무작위로 소화하여 원하는 크기의 조각으로 만듭니다. |
DNA의 우라실 함량을 조절하여 DNA 소화 길이를 제어합니다. |
한 효소는 DNA에 흠집을 내고, 다른 효소는 흠집을 인식하고 상보적 가닥을 절단하여 DNA를 원하는 크기로 조각냅니다. |
특정 부위에 트랜스포존을 통한 삽입을 통해 무작위 DNA 조각을 생성합니다. |
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한정 |
실험은 여러 요인의 영향을 받아 재현성이 낮습니다. 또한 절단 부위의 서열 편향이 나타납니다. |
샘플의 GC 함량은 서열 구성 차이로 인해 단편화 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제 작동 또한 여러 요인에 영향을 받습니다. |
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삽입 부위를 둘러싼 9개 염기쌍에서 서열 편향이 나타납니다. |
끝단 수리 및 A-꼬리 제거
단편화된 DNA는 5' / 3' 돌출부 또는 평활 말단을 가질 수 있습니다 . 모든 돌출부는 평활 말단으로 변환되어야 합니다. 즉, 3' 돌출부는 잘라내고 5' 돌출부는 채워야 합니다. TA 클로닝 전략을 사용한 후속 어댑터 라이게이션을 위해 DNA 단편은 5' 인산화 와 3' 말단에 단일 'A' 뉴클레오타이드를 추가 해야 합니다. 이렇게 하면 단일 3' 'T' 돌출부를 가진 어댑터에 라이게이션할 수 있는 호환 말단이 생성됩니다. 이러한 효소 단계는 T4 DNA 중합효소, T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 , 그리고 Taq DNA 중합효소 에 의해 공동으로 수행됩니다 .
어댑터 결찰
어댑터는 시퀀싱 라이브러리의 핵심 구성 요소 입니다 . 일반적으로 사용되는 Y자형 Illumina 어댑터를 예로 들면, 이 어댑터에는 P5/P7 유동 세포 결합 서열 , 샘플 다중화를 위한 인덱스 서열, 그리고 Rd1/Rd2 SP 결합 부위가 포함되어 있습니다.
- P5/P7 시퀀스는 유동 셀의 상보적 올리고뉴클레오타이드와 교잡되어 브릿지 증폭을 위한 단편을 고정합니다.
- 인덱스는 시퀀싱 중에 풀링된 라이브러리 내 샘플을 구별할 수 있도록 합니다. 라이게이션은 일반적으로 T4 DNA 리가제에 의해 촉진되는데, T4 DNA 리가제는 이중 가닥 DNA의 틈을 메워 어댑터(3' T' 돌출부 포함)를 A-꼬리 DNA 단편에 연결하여 완전한 이중 가닥 분자를 형성합니다.
어댑터 설계는 시퀀싱 기술의 발전에 따라 싱글엔드/페어드엔드 어댑터, UMI 어댑터, 트랜스포사제 호환 어댑터, 전장/단거리 어댑터 등 다양한 응용 분야에 맞게 다양화되었습니다. 어댑터는 다음과 같이 분류할 수 있습니다.
- 플랫폼 : Illumina 어댑터, MGI 어댑터.
- 유형 : 전체 길이(긴) 어댑터, 짧은(짧은) 어댑터.
- 인덱싱 전략 : CDI(Combinatorial Dual Index) 어댑터, UDI(Unique Dual Index) 어댑터.
그림 3: Illumina 및 MGI 플랫폼에서의 단일 색인 라이브러리 구축
그림 4: Illumina 및 MGI 플랫폼에서 의 이중 색인 라이브러리 구축
정화 및 크기 선택
이 단계는 일반적으로 2단계 자기 비드 기반 정제 과정을 포함합니다 . 비드가 더 큰 DNA 단편에 우선적으로 결합하는 원리를 활용하여, 다양한 비드 대 샘플 부피 비율이 사용됩니다.
- 1차 정화: 큰 조각과 원치 않는 복합체를 제거합니다 .
- 2차 정제: 작은 조각과 잔류 시약을 제거합니다.
이렇게 하면 원하는 조각 크기 범위 내에서 라이브러리가 분리됩니다.
그림 5: DNA 단편 정제
그림 6: DNA 단편 크기 선택
라이브러리 증폭
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 시퀀싱을 위해 어댑터-연결된 DNA 단편을 충분한 양으로 생성하는 데 사용됩니다. PCR은 일반적으로 고충실도 DNA 중합효소를 사용합니다. 이 효소는 DNA 합성을 위한 5'→3' 중합효소 활성 과 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있어 증폭 과정에서 잘못 결합된 뉴클레오타이드를 교정할 수 있습니다. 이를 통해 라이브러리 단편의 빠르고 고충실도 증폭이 가능합니다.
DNA 및 RNA 라이브러리 준비 시 NGS 핵심 효소에 대한 지침
예센(Yeasen)은 분자, 단백질, 세포 등 세 가지 주요 생물학적 시약의 연구, 개발, 생산 및 판매를 담당하는 생명공학 기업입니다. 예센 바이오텍은 NGS 라이브러리 구축과 관련된 다양한 효소를 생산합니다. 아래 표에서 가장 적합한 라이브러리 구축 제품을 선택하실 수 있습니다.
표 2. DNA 및 RNA 라이브러리 구축 시 NGS 핵심 효소에 대한 지침
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유형 |
제품 포지셔닝 |
제품명 |
고양이# |
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RNA 라이브러리 구축 |
rRNA 고갈/2가닥 cDNA 합성 |
12906ES |
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rRNA 고갈 |
10325ES |
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1번째 가닥 cDNA 합성 |
14672ES |
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HifairTM IV 역전사효소 (문의) |
11112ES |
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2번째 가닥 cDNA 합성 |
12903ES |
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RNA 라이브러리 구축 및 DNA 라이브러리 구축 |
수리 종료 |
12901ES |
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12902ES |
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dA-테일링 |
13486ES |
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어댑터 결찰 |
10301ES |
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PCR 증폭 |
라이브러리 증폭을 위한 2×Super Canace™ II 고충실도 믹스 |
12621ES |
표 3. DNA 및 RNA 라이브러리 준비 키트
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이름 |
고양이# |
노트 |
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DNA |
Hieff NGS™ DNA 라이브러리 준비 키트 2.0(기계식) |
12927ES |
종양/기계적 방법 |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA 라이브러리 준비 키트 V4(효소) |
12972ES |
종양/효소법 |
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Illumina용 Hieff NGS ™ OnePot II DNA 라이브러리 준비 키트 |
13490ES |
병원체/효소/정규시간(140분) |
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12316ES |
병원체/효소/초고속(100분) |
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RNA |
12308ES |
올리고 dT 자기 비드 없음, 11개 튜브 |
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12340ES |
사전 혼합 버전(액티노마이신 D 무함유) |
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12254ES |
식물 |
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12257ES |
인간 |