cDNA를 얼마나 사용해야 할지 모르시겠어요? 아직도 cDNA 농도를 측정하고 계신가요?

정량 PCR(qPCR)은 분자생물학에서 널리 사용되는 기술로, 종종 간단해 보입니다. 하지만 qPCR 실험의 성공은 미묘하지만 중요한 여러 요소에 달려 있습니다. 가장 간과되는 측면 중 하나는 cDNA 주형입니다. cDNA의 질과 양은 실험의 성공 여부를 직접적으로 결정합니다. cDNA를 제대로 준비하지 않으면 qPCR 실험이 실패합니다. 이 글에서는 qPCR에서 cDNA를 사용하는 방법을 자세히 설명하고 이 첫 번째 중요한 장애물을 극복하는 데 도움을 드리겠습니다. (네, qPCR에는 훨씬 더 많은 기술적 함정이 있습니다. 앞으로의 게시물도 기대해 주세요!)

적절한 양의 cDNA를 결정하는 방법

1. Nanodrop으로 cDNA 농도를 측정할 수 있나요?
권장하지 않습니다. 역전사 산물은 전사되지 않은 RNA, 효소, cDNA, 그리고 다양한 염이나 이온을 포함하는 복잡한 혼합물입니다. Nanodrop과 같은 UV 흡광도는 RNA와 DNA를 구분할 수 없으며 단백질과 염 오염 물질의 영향을 받기 쉽습니다. 결과적으로 측정된 농도가 부정확하고 후속 qPCR 정량 분석에 적합하지 않습니다.

2. 겔 전기영동으로 cDNA 품질을 평가할 수 있나요?
거의 없습니다. 총 RNA는 모든 크기의 전사체를 포함하고 있기 때문에 cDNA 산물은 아가로스 젤에 번진 것처럼 보입니다. 게다가 역전사는 PCR처럼 물질을 증폭시키지 않기 때문에 전체 cDNA 수율이 낮습니다. 밴드가 희미하거나 심지어 보이지 않을 수도 있습니다.

(예: 겔 전기영동으로 얻은 cDNA 도말 패턴 - 이미지 출처: 인터넷)

 3. 최적의 cDNA 희석을 결정하는 방법은 무엇입니까?
cDNA를 여러 번 희석하고 각각에 대해 qPCR을 수행하세요. Ct 값이 15~30회 사이인 희석 비율을 선택하세요. 이 범위가 가장 이상적입니다.
또는 희석하지 않은 cDNA로 시작하여 초기 Ct 값에 따라 조정합니다. Ct는 템플릿 양과 대수적으로 연관되므로(ΔCt = 1 = 2× 농도 차이), 적절한 희석 비율을 역산할 수 있습니다.
예: Ct = 12는 너무 낮습니다. Ct = 16을 얻으려면 2⁴ = 16×를 희석합니다.

4. 표적 유전자와 참조 유전자의 Ct 값이 크게 다르다면 어떻게 되나요?
동일한 희석률을 사용했음에도 불구하고 Ct 값이 유의미하게 차이가 난다면 유전자 발현에 큰 차이가 있음을 의미합니다. 표적 유전자와 참조 유전자 모두 15~30 Ct 범위 내에 있도록 희석률을 다르게 적용할 수 있습니다. 단 , 각 유전자 내에서 모든 실험군에서 희석률이 일관되게 유지되도록 해야 합니다.

고품질 cDNA를 얻는 방법

1. RNA 추출 및 저장
신선한 샘플을 액체 질소에 급속 냉동하거나 RNA 안정화 시약에 보관하여 사용하십시오. -80°C에 보관하고 반복적인 동결-해동 사이클은 피하십시오.
TRIzol 또는 시판 키트를 사용하여 RNA를 추출하십시오. 적절한 개인 보호 장비(PPE)와 인증된 RNase-free 소모품을 착용하고 RNase-free 환경에서 작업하십시오.
RNA를 RNase가 없는 물에 녹여 단기적으로는 -20°C에, 장기적으로는 -80°C에 보관합니다.
UV 흡광도를 사용하여 순도를 평가합니다(A260/280 ≥ 2.0; A260/230 ≈ 1.8–2.1). 그러나 이 방법은 RNA 무결성을 평가하지 않습니다. 분해 및 오염 물질 확인을 위해 겔 전기영동을 권장합니다.

 

(고품질 RNA 젤은 5S, 18S, 28S 밴드를 선명하게 보여줍니다. 28S 밴드는 18S 밴드의 두 배 강도여야 합니다.)

2. 게놈 DNA 오염 제거
게놈 DNA(gDNA) 오염은 비특이적 증폭이나 비정상적으로 낮은 Ct 값을 초래할 수 있습니다. 인트론 스패닝 프라이머와 gDNA 제거 단계가 포함된 DNA 제거 추출 키트 또는 역전사 키트를 사용하십시오.

3. 올바른 역전사 프라이머 선택

프라이머 유형	특징	장점	단점	조합방법
올리고(dT)	12~20개의 T 염기가 폴리-A 꼬리에 결합합니다.	전장 cDNA 합성	폴리아데닐화된 mRNA에만 해당; 템플릿 품질에 민감함
랜덤 프라이머	6~9개의 염기가 무작위로 결합	복잡하거나 풍부하지 않은 템플릿에 적합	특이성이 낮고 단편이 짧음
유전자 특이적 프라이머(GSP)	특정 RNA 서열을 결합하다	높은 민감도와 특이성	타겟 특정 cDNA만 생성합니다

mRNA qPCR의 경우, oligo(dT) 프라이머와 랜덤 프라이머를 혼합하는 것이 일반적으로 권장됩니다.

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