플라스미드 추출은 박테리아 세포에서 플라스미드 DNA를 분리하는 데 사용되는 기본적인 분자생물학 기술입니다. 필요한 수율과 후속 응용 분야에 따라 플라스미드 추출 방법은 미니프렙(miniprep) , 미디프렙(midiprep ), 맥시프렙(maxiprep) 으로 분류할 수 있습니다. 규모와 정제 수준은 다르지만, 모든 방법은 세포 용해 , 오염 물질(예: 단백질 및 RNA) 제거 , 그리고 플라스미드 DNA 정제 및 용출이라는 동일한 핵심 원리를 기반으로 합니다 .
플라스미드 추출의 기본 워크플로
일반적인 단계는 사용된 키트나 프로토콜에 따라 약간씩 다를 수 있지만 일반적으로 다음이 포함됩니다.
1. 준비
세균 배양 : 표적 플라스미드를 함유하는 세균을 적절한 항생제가 들어 있는 LB 배지에 접종하여 하룻밤 동안 배양합니다.
세포 수확 : 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 버립니다.
2. 세포 용해
용해 완충액을 첨가합니다 . 일반적으로 세포막을 파괴하고 단백질과 염색체 DNA를 변성시키기 위해 NaOH와 SDS가 포함되어 있습니다.
부드러운 혼합 : 완전하고 균일한 용해를 보장합니다.
3. 중화
중화 완충액을 첨가합니다 . 일반적으로 단백질, 염색체 DNA, 세포 파편을 침전시키기 위해 아세트산 칼륨 용액을 사용합니다.
온화한 역전 : 플라스미드 DNA를 전단하지 않고 침전을 용이하게 합니다.
4. 원심분리
침전물 제거 : 원심분리기를 사용하여 플라스미드가 포함된 상층액과 세포 파편을 분리합니다.
5. DNA 정제
컬럼 기반 정제 : 상층액을 실리카 막이나 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 플라스미드 DNA를 결합합니다.
세척 : 세척 완충액을 사용하여 잔류 단백질, 염, RNA를 제거합니다.
6. DNA 용출
정제된 플라스미드 DNA 용출 : 뉴클레아제가 없는 물이나 TE 완충액(Tris-EDTA)을 사용하여 DNA를 회수합니다.
일반적인 문제 및 문제 해결
표준화된 키트를 사용하더라도 플라스미드 추출은 때때로 수율 저하나 오염을 초래할 수 있습니다. 다음은 일반적인 문제와 그 해결책입니다.
1. 낮은 DNA 수율
가능한 원인 :
- 세균 증식이 불충분하다
- 불완전한 세포 용해
- 원심분리 또는 정제 중 DNA 손실
솔루션 :
- 야간 배양이 농축되었는지 확인하십시오(OD600 ~1.8–2.0)
- 용해 시간 및 시약량 최적화
- 적절한 타이밍과 속도를 위해 원심분리 단계를 확인하세요.
2. DNA 순도 저하
가능한 원인 :
- 단백질 오염
- RNA 오염
- 세척이 완료되지 않음
솔루션 :
- 용해 중 또는 용해 후에 RNase A를 추가합니다.
- 세척 단계 또는 볼륨을 늘리세요
- 원심분리 속도가 올바른지 확인하세요
3. DNA 분해
가능한 원인 :
- 긴 처리 시간
- DNase 오염
- 성능이 저하되거나 만료된 시약
솔루션 :
- 얼음 위에서 빠르게 작업하세요
- DNase가 없는 소모품 및 시약을 사용하세요
- 필요에 따라 신선한 용해 완충액을 준비하세요
4. 노란색 DNA 용액
가능한 원인 :
페놀 또는 유기 용매 오염(페놀/클로로포름을 사용한 경우)
솔루션 :
- 세척 단계를 철저히 반복하세요
- 유기 추출 중 완전한 상 분리를 보장합니다.
5. 비정상적인 A260/A280 또는 A260/A230 비율
가능한 원인 :
- A260/A280 < 1.8: 단백질 오염
- A260/A280 > 2.0: RNA 오염
- A260/A230 < 2.0: 염, 탄수화물 또는 에탄올 존재
솔루션 :
- RNase A로 처리
- 추가 세척 단계를 추가하거나 버퍼 구성을 수정하세요.
6. 가시적인 DNA 침전
가능한 원인 :
- 에탄올 또는 이소프로판올의 불완전한 제거
- 용출 중 과농축
솔루션 :
- 세척 후 튜브를 완전히 자연 건조시키세요.
- 과도한 농축을 방지하기 위해 용출량을 조절하세요.
7. DNA의 높은 점도
가능한 원인 :
- 높은 플라스미드 농도
- 대형 플라스미드 구조
솔루션 :
- 용출량 증가
- 기계적 전단을 피하기 위해 피펫팅에 주의하세요
8. DNA 오염
가능한 원인 :
- 비멸균 기술
- 오염된 시약 또는 작업 영역
솔루션 :
- 인증된 뉴클레아제 무첨가 소모품을 사용하세요
- 깨끗하고 통제된 환경에서 작업하세요
9. 플라스미드 DNA의 높은 내독소 수치
높은 내독소 수치는 문제가 될 수 있는데, 특히 플라스미드 DNA가 세포 형질 전환 , 생체 내 실험 또는 치료제 개발 에 사용되는 경우 더욱 그렇습니다 .
일반적인 원인 :
- 오염된 배양 배지
- 세균 세포벽의 불완전 용해
- 부적절한 정화 단계
- 무균 기술이 부족함
솔루션 및 모범 사례
내독소가 없는 성장 배지를 사용하세요
인증된 엔도톡신 무함유 LB 배지 또는 시약을 선택하세요
용해 조건 최적화
내독소 이월을 줄이기 위해 세포벽을 완전히 분해합니다.
정화 단계 강화
엔도톡신 제거 세척 완충액 또는 전용 엔도톡신 무함유 플라스미드 키트를 사용하세요.
무균 기술을 유지하세요
멸균되고 내독소가 없는 팁, 튜브 및 버퍼를 사용하여 깨끗한 벤치에서 작업합니다.
내독소 검사
LAL 분석 (Limulus Amebocyte Lysate)을 활용하여 내독소 수치를 모니터링합니다.
내독소 제거 첨가제를 사용하세요
용해 또는 세척 완충액에 특수 세제나 킬레이트제를 첨가합니다.
원심분리 조건 개선
펠릿 형성 및 불순물 제거 극대화
열차 인원
직원들이 무균 및 정밀 취급에 대한 적절한 교육을 받았는지 확인하십시오.
내독소가 없는 실험실 기구를 사용하세요
오염 위험을 줄이려면 인증된 소모품을 사용하세요
결론
플라스미드 추출의 원리와 잠재적 위험을 이해하는 것은 분자생물학 분야에서 고품질 DNA를 얻는 데 필수적입니다. 유전자 클로닝, 형질감염, 또는 치료제 개발 등 어떤 분야에서든 배양 조건부터 최종 정제까지 모든 단계를 최적화하는 것은 실험의 신뢰성과 재현성을 보장합니다.
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