TRIzol 시약은 주로 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유하고 있습니다. 이 성분들은 세포를 빠르게 용해시키는 동시에 샘플에서 방출되는 RNase의 활성을 억제합니다. TRIzol은 세포를 파괴하고 단백질을 변성시켜 핵산과 단백질을 분리합니다. 용액의 pH는 DNA와 RNA가 수용액 또는 유기액으로 분리되는지 여부를 결정합니다. pH ≥7.0에서는 DNA와 RNA 모두 수용액에 존재합니다. pH가 7.0 미만이면 DNA는 변성되어 계면 또는 유기액으로 이동하고, RNA는 수용액에 남습니다.
TRIzol 시약은 산성(pH 5 정도)이므로 상 분리 과정에서 RNA가 상층 수용액에 남아 있게 됩니다. 클로로포름을 첨가하고 원심분리하면 수용액을 분리하고 이소프로판올을 사용하여 RNA를 침전시킬 수 있습니다.
그림 1: TRIzol 시약을 사용한 mRNA 추출 중 상 분리
TRIzol은 다양한 유형의 시료에 널리 적용 가능하지만, 추출 과정에서 이상 현상이 발생할 수 있습니다. 다음은 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 해결책입니다.
1. TRIzol은 냉장고에서 꺼낼 때는 흐릿해 보이지만 나중에 투명해집니다.
이는 일반적으로 정상적인 현상입니다. TRIzol에는 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트와 같은 유기 성분이 포함되어 있어 저온에서 탁해질 수 있습니다. TRIzol 병을 냉장고의 차가운 곳, 특히 온도가 4°C 이하로 떨어질 수 있는 냉장고 뒷벽 근처에 보관하면 탁해질 수 있습니다. 이는 일반적으로 성능에 영향을 미치지 않습니다. 이를 방지하려면 온도가 더 안정적인 냉장고 문 근처에 TRIzol을 보관하십시오.
2. TRIzol로 샘플을 균질화한 후 불용성 물질이 존재합니다.
이는 세포 또는 조직 파편으로 인해 발생하는 경우가 많으며, 이는 효율적인 RNA 회수를 방해할 수 있습니다. 균질화 후 5분간 실온에서 배양한 후에도 불용성 물질이 남아 있으면 클로로포름을 첨가하기 전에 4°C에서 12,000 × g로 10분간 원심분리하십시오. 맑은 상층액과 젤라틴 형태의 펠릿이 나타나야 합니다. 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고 프로토콜을 계속 진행하십시오.
3. 상 분리 후 수용액 상의 색상이 비정상적임(예: 황갈색, 연분홍, 붉은색).
그림 2: 상 분리 후 수용액상의 비정상적인 색상
이는 샘플에 따라 다를 수 있습니다.
- 피부 조직 : 지질과 멜라닌이 풍부합니다. 지질 방울은 색소를 함유하여 수성층을 착색시킬 수 있습니다. 클로로포름 추출 전에 균질액을 원심분리하여 표면의 지질층을 제거하십시오.
- 혈액이 풍부한 검체 : 헤모글로빈은 수용액의 탁도나 황변을 유발할 수 있습니다. 또한, 저온에서 원심분리를 하지 않으면 헤모글로빈의 철분으로 인해 유기물이 어두워질 수 있습니다. 혈액 오염을 줄이기 위해 PBS로 검체를 미리 세척하십시오.
- TRIzol 용량 부족 : 특히 혈액과 같은 액체 샘플의 경우, 샘플 대 TRIzol 비율이 1:10을 초과하면 조기 상 분리가 발생하여 DNA 오염이 증가할 수 있습니다. TRIzol을 추가하거나 액체 샘플용으로 설계된 TRIzol 제형으로 전환하십시오.
- 높은 염분 또는 단백질 함량 : 위와 유사하게, 이 또한 조기 분리를 유발할 수 있습니다. 샘플을 미리 세척하거나 TRIzol 용량을 늘리세요.
4. 클로로포름을 첨가하고 원심분리한 후에는 흰색 계면상이 나타나지 않습니다.
그림 3: 클로로포름을 첨가하고 원심분리한 후에는 흰색 계면상이 나타나지 않습니다.
가능한 원인:
- 혼합 부족 : 클로로포름을 첨가한 후 완전히 볼텍싱합니다. 원심분리하기 전에 혼합물이 유백색이어야 합니다. 투명해지면 다시 혼합하고 원심분리합니다.
- 샘플 투입량이 적음 : 샘플량이 적으면 계면이 희미하거나 없을 수 있습니다. 주의해서 진행해야 하며, RNA 침전을 촉진하기 위해 글리코겐과 같은 운반체 사용을 고려하십시오.
5. 원심분리 후 이소프로판올을 첨가하기 전에 튜브 바닥에 침전물이 형성됩니다.
이는 다당류 또는 세포막 잔류물일 가능성이 높습니다. 혈액 함량이 높은 검체(예: 간)에서는 붉은색의 끈적끈적한 층이 나타날 수도 있습니다. 이 층에는 혈액 유래 성분이 포함되어 있으므로 버려야 합니다. 위의 수용액층만 보관하십시오.
6. RNA 펠릿의 색상이나 농도가 비정상적입니다.
그림 4: mRNA 추출 후 RNA 펠릿의 비정상적인 색상 또는 일관성
일반적으로 RNA 펠릿은 투명하거나 흰색으로 보입니다. 특이한 색상이나 질감(예: 갈색, 회색, 젤라틴)은 다음과 같은 원인으로 인해 발생할 수 있습니다.
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샘플 구성 :
- 곤충 : 갈색 침전물을 유발하는 키틴, 왁스 또는 폴리사카라이드를 함유하고 있습니다.
- 폴리페놀/폴리사카라이드가 풍부한 조직 : 색깔이 있거나 젤 같은 펠릿이 생성될 수 있습니다. 투입량을 줄이고 분쇄 시 PVP를 첨가하거나 해당 조직용으로 설계된 키트로 전환하는 것을 고려하십시오.
- 색깔이 있는 수용액이 이미 관찰된 경우 3호를 참조하세요.
- 작동 오류 : 계면층/유기층을 실수로 흡인하면 RNA가 오염될 수 있습니다. 수용액을 클로로포름으로 다시 추출하여 정제하십시오.
7. 침전 후 RNA 펠릿이 보이지 않음.
가능한 이유:
- RNA 함량 낮음 : 이소프로판올을 첨가한 후 4°C 또는 -20°C에서 10~30분 동안 침전시킵니다. 펠릿이 여전히 보이지 않으면 디캔팅을 하지 말고, 보이지 않는 펠릿의 손실을 방지하기 위해 피펫팅을 사용하여 상층액을 제거합니다. 저투입량 샘플에서 RNA 회수율을 높이기 위해 운반체(예: 글리코겐 또는 선형 폴리아크릴아마이드)를 첨가합니다. 경우에 따라 연어 정자 DNA를 사용할 수도 있습니다.
- 부적절한 에탄올 세척 : 에탄올 농도가 너무 낮으면 RNA가 용해되거나 손실될 수 있습니다. 에탄올은 뉴클레아제가 없는 물로 새로 준비해야 합니다.
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제품 포지셔닝 |
제품명 |
고양이 # |
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RNA 추출 |
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