Cap構造は、mRNAワクチンおよび治療薬の開発に不可欠な要素です。合成mRNA技術では、Cap1を利用することで安定性と翻訳効率を高め、Toll様受容体（TLR）やその他の免疫センサーによるmRNAの自然免疫認識を抑制し、不要な免疫活性化を最小限に抑えます。これにより、望ましくない炎症反応が抑制され、ヒト細胞における治療用mRNAの安定性と有効性が向上します。
初期の発見とCap0の構造
1970年代半ば、真核生物のmRNA研究において、現在Cap0として知られる5'末端構造が発見されました。これは、5'末端の最初のヌクレオチドにN7メチルグアノシンキャップ（m7G）が付加されたものです。この修飾は、mRNAをエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、核外輸送を助け、翻訳開始のためのリボソーム認識を促進することが分かりました。Cap0は、メチル化がグアノシンキャップ自体に限定された、初めて特徴付けられたキャップ構造でした。この5'キャップとその機能の発見は、真核生物のmRNAキャップと、それらがmRNA修飾において果たす役割の理解において、大きな飛躍的進歩となりました。
Cap1の出現
真核生物mRNAの重要な特徴であるCap1構造は、mRNAの安定性、翻訳、そして免疫認識において極めて重要な役割を果たします。mRNAのキャップ構造は、5'-5'三リン酸結合を介して最初のヌクレオチドに結合したN7メチルグアノシン（m7G）で構成され、1970年代の真核生物mRNAの転写後修飾に関する初期の研究から発展しました。
5'末端キャップされたmRNAの構造【1】。さらに調査を進めたところ、ほとんどの真核生物のmRNAにおいて、キャップに続く最初のヌクレオチド（位置+1）は、リボースの2'-O位でもメチル化されており、このプロセスは2'-O-メチル化として知られる。Cap1構造（m7GpppNm）として知られるこの発見は、mRNA修飾に機能的意義をさらに一層加えた。Cap1修飾は、特に哺乳類細胞において、mRNAの安定性を微調整し、自然免疫系による免疫認識を防ぐことがわかり、RIG-I、TLR、MDA5などのパターン認識受容体による認識を回避するのに役立つ【2】。これは、mRNA代謝と、mRNAワクチンや遺伝子治療への応用を含むmRNAベースの技術の進歩の両方にとって極めて重要であった。
mRNA業界における技術的課題と現在の解決策
mRNAワクチンの広範な応用と最適化には、高用量mRNA、免疫応答、安定性、そして送達といった技術的課題が依然として残っています。mRNA業界における大きな課題の一つは、強力な免疫応答を誘発するために高用量mRNAが必要となることです。これはいくつかの要因によるものです。
急速な分解: mRNA は本質的に不安定であり、生物系に存在する脱キャップ酵素やリボヌクレアーゼ (RNase) によって分解されやすいです。
限られた翻訳効率： mRNAからタンパク質への翻訳効率は変動し、免疫応答に十分な抗原レベルを生成するには、より多くのmRNAが必要になります。翻訳効率は、Cap1と翻訳開始因子eIF4Eの親和性に関連しています。
真核生物における基本的な翻訳開始複合体の形成【3】
免疫原性と望ましくない免疫反応： 3番目に大きなハードルは、mRNA自体、特にdsRNAや不完全mRNAによって引き起こされる自然免疫反応です。獲得免疫系を刺激するためにはある程度の免疫活性化が望まれますが、過剰な活性化は炎症反応を引き起こし、ワクチンの有効性を低下させたり、副作用を引き起こしたりする可能性があります。
キャッピング技術の歴史
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酵素キャッピング技術： mRNA研究の初期に導入された酵素キャッピング技術は、グアニルトランスフェラーゼやメチルトランスフェラーゼなどのキャッピング酵素を用いて、転写後に天然の5'キャップを付加するものです。この方法は、特に治療用途において、mRNA翻訳において高い忠実度とキャッピング効率を保証します。
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合成キャップアナログ（1980年代～2000年代）：研究者らは、キャップされたmRNAをin vitro合成するための合成キャップアナログを開発し、mRNAの機能と遺伝子発現の研究に役立てました。アンチリバースキャップアナログ（ARCA）は、mRNA合成中に誤ったキャップの組み込みを防ぐように設計された合成キャップアナログであり、ワクチンや遺伝子治療におけるmRNAの翻訳効率を向上させます。しかし、ARCAキャッピングのキャッピング効率と収率は低いという問題がありました。
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Cap1テクノロジー（2010年代）： mRNA合成中にキャップを直接組み込むことでプロセスを簡素化するCap1共転写キャッピング法。この方法は効率性を高め、正しくキャップされたmRNAを高い割合で生成するため、mRNAワクチンなどの大規模な治療用途に最適です。
現在、酵素キャッピング技術は、COVID-19ワクチンを含むmRNAベースの治療法の開発において非常に重要であり、治療用mRNAの安定性と効果的な翻訳を確保しています。
酵素キャッピング、次世代LZCapキャッピング、第一世代キャッピング（ARCA）法の比較
次世代キャップアナログの開発
私たちは、脱キャップ酵素に対する耐性、eIF4Eへの高い親和性による翻訳効率の向上、そして免疫原性の低減を備えたキャップ類似体の開発を目指しました。これらの進歩は、抗がん治療や遺伝子治療への応用を含む、mRNAをベースとした治療の有効性を高めるために不可欠です。
LZCapの設計
LZCapの設計においては、eIF4Eに高い親和性を持つキャップ類似体の創出に主眼を置きました。酵素は基質に対して比較的「特異的」な認識を示します。そのため、新しいキャップ構造を設計する際には、天然／既知の構造との類似性を可能な限り維持するよう努めました。天然構造はリボースの3'-OH基を有しており、これは修飾（例えばメチル化）が可能です。この観点から、新規性を高めるために3'-位に炭素を付加し、続いてOH基の水素結合を模倣するためにNH基を付加し、さらにNH基の塩基性を低下させて水素結合能を高めるためにアセチル基を付加しました。LZCapの活性はメチル化された天然キャップよりも優れており、これはおそらく水素結合の増加によるものです。メチル基やメトキシ基と比較して、アセチルアミノ基は基質（キャップ）と開始因子（酵素）間のファンデルワールス相互作用を増加させる可能性もあります。
アセチルアミノ基の安定性
アセチルアミノ基は既に十分に安定しており、キャップの中で最も安定性の低い7位メチル化部位とリン酸ジエステル結合よりもはるかに安定しています。
LZCapの収量とキャッピング効率
LZCap AG(3'Acm)キャップは、ルシフェラーゼmRNAのキャッピング効率が約97.59%で、T7 RNAポリメラーゼを用いた標準的なin vitro転写（IVT）反応において、1μgのDNAテンプレートから最大200μgのキャップ化mRNAが得られます。LiCl沈殿のみでmRNAの純度は最大99%です。この高いキャッピング効率と収量により、LZCapはタンパク質生産や遺伝子治療など、様々な用途において魅力的な選択肢となります。
Cap構造は、mRNAワクチンおよび治療薬の開発に不可欠な要素です。合成mRNA技術は、Cap1を利用することで安定性と翻訳効率を高め、Toll様受容体（TLR）やその他の免疫センサーによるmRNAの自然免疫認識を抑制し、不要な免疫活性化を最小限に抑えます。これにより、不要な炎症反応が抑制され、ヒト細胞における治療用mRNAの安定性と有効性が向上します。
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製品 |
キャップ AG (3'- O Me-7mG) |
LZキャップ AG(3フィートAcm) |
AG （キャッピングなし） |
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mRNA収量 （μg） |
164 |
173 |
200 |
RNAse Hをベースとした方法によるLZCappedルシフェラーゼmRNAのキャッピング効率のMS分析。キャッピング効率は約97.59%であった。
脱キャップ酵素に対するmRNAの安定性はどうですか？
LZCap AG(3'Acm)およびLZCap AG M6(3'Acm)を有するmRNAは、脱キャップ酵素（NEB）に対して高い耐性を示します。CapM6(3'-OMe-6mA-7mG)も脱キャップ酵素に対して耐性を示しますが、通常のCap AG(3'-OMe-7mG)は耐性を示さないことが注目されます。
LZCap と eIF4E の結合親和性はどうですか?
LZCap AG(3'Acm)キャップされたmRNAのタンパク質発現はどうでしょうか?
LZCap AG（3'Acm）キャップドルシフェラーゼmRNAの発現は、様々な細胞株*（3T3-L1、Hela、JAWs、HEK293T、Huh7）において、Cap1類似体（3'-OMe-7mG）キャップドmRNAよりも有意に高くなっています。130回の反復実験では、LZCap AG（3'Acm）キャップドルシフェラーゼmRNAの発現は、（3'-OMe-7mG）キャップドmRNAの平均約1.5倍高いことが示されました。マウスでも同様の結果が得られました。タンパク質の発現レベルは、mRNAの配列によって若干異なる場合があります。
動物に関する他のデータはありますか?
LZCap AG(3'Acm)またはLZCap AG(3'FMom)キャップの発現効率
GLuc をコードする mRNA は、カニクイザルおよびブタにおいて CapAG (3'-OMe-7mG) キャップされた mRNA と比較して、より高い生体内発現を示します。
LZCap AG キャップされた mRNA の自然免疫原性はどうですか?
LZCapAG（3'Acm）キャップ付きmRNAは低い自然免疫原性を示します。TLR8、TLR7、IL-1A、およびBは、キャップなしRNAによって誘導される免疫応答において重要な役割を果たします。LZCapped mRNAの免疫原性解析に関するin vivo研究では、キャップなしRNAがマウスにおいて免疫関連因子の転写レベルに有意な変化を引き起こすことが示されました。LZCapおよび3'-OMe-7mGキャップ付きmRNAは、いずれもマウスにおいて、単回RNA刺激投与後に免疫因子の転写レベルが同様に低下しました。 
安全性テストは行いましたか?
はい、細胞毒性試験、ヒトポリメラーゼ阻害研究、およびエイムス試験を実施しました。
- 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）のヌクレオシドモノマーは、293T、Huh7、MRC5、THP1およびU87MG細胞において細胞毒性がほとんどないか全く観察されませんでした。
- ヒト DNA ポリメラーゼ (α、β、γ、およびクレノウ) およびミトコンドリア RNA ポリメラーゼ (hPOLRMT) の活性阻害研究では、3'-Acm-7mG TP はヒト DNA または RNA ポリメラーゼを阻害しないことが示されています。
- 細菌を用いた復帰突然変異試験（エームス試験）は、関連する遺伝子変異を検出するとともに、ほとんどのげっ歯類およびヒトにおける遺伝毒性発がん物質を検出します。エームス試験では、3'-Acm-7mGに遺伝毒性がないことが示されました。
この製品は特許を取得していますか？
はい。米国で特許を取得しています。
注文情報
| 製品名 | 仕様 | カタログ番号 |
| LZCap AG(3'Acm)（100 mM） | 100μL、1mL | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm) （ 100 mM ） | 100μL、1mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（100 mM） | 100μL、1mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100μL、1mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7) （ 25 mM ） | 100μL、1mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Ma-ビオチン) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) ホタルluc mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
| LZCap (AG(3'Acm) グルコース mRNA (1μg/μL) | 100μL、1mL | 問い合わせ |
参照：
- コロナウイルスRNAキャッピングとメチル化の分子メカニズム、Virologica Sinica 31(1)
- mRNAワクチン — ワクチン学の新時代. Nat. Rev. Drug. Discov. 17, 261–279 (2018).
- 哺乳類におけるRNA結合タンパク質による翻訳開始の制御：トランスアクティング因子による翻訳開始複合体の調節、Cells 2021, 10(7), 1711
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