下室への移動を阻害
この問題は、不十分な走化性勾配、または下部チャンバーに有効な走化性因子が存在しないことが原因である可能性があります。これに対処するには、アッセイの12～24時間前に細胞を血清飢餓状態にして細胞周期を同期させることを検討してください。適切な陰性対照および陽性対照が含まれていることを確認してください。また、下部チャンバーの血清またはその他の走化性因子の濃度を高めることもできます。さらに、過剰な細胞継代は細胞生存率と遊走能力を低下させる可能性があるため、継代数の少ない細胞の使用が推奨されます。もう一つの重要な要素は、Transwellインサートのポアサイズです。ポアサイズが小さすぎると細胞遊走が阻害される可能性があるため、ポアサイズの大きいインサートを使用することで改善が見られる場合があります。浸潤アッセイでは、マトリゲル層が厚すぎると遊走が阻害される可能性があります。予備実験では、マトリゲル層の量を減らし、インキュベーション時間を最適化することを検討してください。最後に、メンブレンインサート下の気泡は細胞遊走を妨げる可能性があるため、注意してください。セットアップ中に気泡を除去するように注意してください。
細胞の過剰移動または過少移動
適切な細胞播種密度とインキュベーション時間を決定するために、コントロール細胞株を用いた予備的な最適化実験を行うことをお勧めします。播種時の細胞状態不良、不正確な細胞計数、あるいは体積計算の誤りは、いずれも遊走に影響を与える可能性があります。計数中に細胞生存率が低い場合は、実験を延期してください。均一な分布を維持するために、計数前と播種前に細胞を十分に再懸濁してください。
染色後の細胞分布の不均一性
均一な分布を確保するため、インサートは必ず平らな面に置いてください。播種前に細胞懸濁液をよく混合してください。播種後、インサートは安全キャビネット内で静置し、しばらく静置してからインキュベーターに移してください。移送中は、インサートが傾いたり振動したりしないよう丁寧に扱い、インキュベーターのドアはしっかりと閉めて揺れを防いでください。細胞凝集が著しく見られる場合は、洗浄回数を増やすか、培地を交換して凝集塊や凝集体を除去してください。
一貫性のない実験再現性
まず、細胞カウントの不正確さや播種前の細胞懸濁液の混合不良が要因となっているかどうかを評価します。細胞をインサートに加える前に、毎回懸濁液を混合することをお勧めします。実験プロトコルを標準化し、試薬や消耗品を同一バッチで使用することでも、再現性を向上させることができます。
実験群と対照群の間に明確な違いがない
いくつかの要素を考慮する必要があります。膜の孔径が細胞の種類に適していることを確認すること、遊走能が低下する可能性のある過度に継代された細胞の使用を避けること、セットアップ時に走化性因子の勾配が正しく確立されていることを確認することなどです。各処理群に陽性対照を加えることで、手順上の誤りを特定しやすくなります。観察前に、インサートの上面を徹底的に洗浄し、観察を妨げる可能性のある残留細胞や汚れを除去してください。
移動または侵入した細胞の曖昧な可視化
これは、バックグラウンド染色が強いことが原因である可能性があります。バックグラウンドを除去するためにインサートメンブレンを拭く際は、清潔な試薬を使用し、慎重に取り扱ってください。優しく複数回拭く必要がある場合もあります。インサートメンブレンは多孔質であるため、イメージング中は細胞とメンブレンの孔を区別するように注意してください。細長い形状や広がった形状が観察されない場合は、インキュベーション時間が短すぎた可能性があります。インキュベーション時間を延長すると、浸潤細胞や遊走細胞の観察が改善される可能性があります。
製品概要
|
製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
|
1ロール |
36125ES03 |
|
|
20T/50T/100T |
40302ES20/50/60 |
|
|
20T/50T/100T |
40305ES20/50/60 |
|
|
10mL/100mL |
40202ES80/92 |
|
|
1mL/5×1mL/50×1mL/100×1mL |
11184ES03/08/50/60 |
|
|
1mL/5×1mL |
11188ES03/08 |
|
|
1mL/5×1mL |
11189ES03/08 |
|
|
1mL/5×1mL |
11190ES03/08 |
|
|
1mL/5×1mL |
11171ES03/08 |
|
|
20トン/200トン |
11175ES20/70 |