生命の基本単位である細胞の活力は、生物の健康状態と疾患の進行を直接反映します。細胞生存率の評価は、細胞に対する包括的な「身体検査」のようなものです。研究者や臨床医は、生理機能、薬剤の効果、疾患発症のメカニズムについてより深い洞察を得ることができます。
今日は、細胞増殖、細胞毒性、生存率アッセイの世界を詳しく調べ、最も一般的に使用されている重要な検出方法のいくつかを探ってみましょう。
1. トリパンブルー染色：細胞死の直接評価
トリパンブルーは大きな陰イオン性色素です。生細胞の細胞膜は選択的透過性を示し、色素を透過しません。一方、死細胞は膜の完全性を失い、トリパンブルーが細胞内に入り込み、青く染まります。そのため、青く染まった細胞は死細胞とみなされ、染まっていない細胞は生細胞とみなされます。
トリパンブルー排除法は、継代後や解凍後など、細胞培養中の品質管理に広く用いられています。また、明らかな毒性を持つ薬剤や化学物質の予備スクリーニングのための細胞毒性試験にも用いられています。しかし、この方法は生細胞と死細胞を区別するのみであり、細胞生存率に関する定量的なデータは得られません。軽度に損傷を受けた細胞やアポトーシスの初期段階にある細胞を正確に評価できない可能性があります。
2. MTTアッセイ：細胞生存率を評価するための古典的な方法
MTTアッセイは、細胞生存率分析において広く用いられている古典的な手法です。このアッセイは、黄色の化合物であるMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物）が生細胞中のミトコンドリアコハク酸脱水素酵素によって還元され、青紫色の不溶性ホルマザン結晶を形成するという原理に基づいています。これらの結晶は、均一な色の分布を得るためにDMSOを用いて可溶化されます。吸光度は通常570 nmで測定され、吸光度が高いほど細胞生存率が高いことを示します。
図1. MTTアッセイの原理
MTTアッセイの利点は、その簡便性、低コスト、そして信頼性の高い結果です。細胞増殖研究、細胞毒性試験、薬物スクリーニングなどで広く用いられています。
3. CCK-8アッセイ：MTT法の改良版
Cell Counting Kit-8（CCK -8）アッセイは、MTTアッセイの改良版と考えられています。より感度の高い基質であるWST-8（2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウムモノナトリウム塩）を使用します。WST-8は生細胞内の細胞内脱水素酵素によって還元され、水溶性のオレンジ色のホルマザン生成物を生成します。このホルマザン生成物は追加の可溶化ステップを必要とせず、培養液中で直接測定できます。検出は450 nmで行います。
図2. CCK-8アッセイの原理
CCK-8アッセイはMTTアッセイと比較して、直線性、感度、細胞毒性の低さが優れているため、長期培養や繰り返し測定に適しています。ただし、比較的高価であり、特定の細胞種や過酷な条件の影響を受ける可能性があります。
4. 代謝活性アッセイ：細胞の「発電所」をモニタリング
ATP（アデノシン三リン酸）含量アッセイは、生細胞は継続的にATPを合成する一方、細胞死に伴いATPレベルが急速に低下するという原理に基づいています。ルシフェラーゼ-ルシフェリンなどのシステムを用いることで、ATP含量を正確に定量化することができ、細胞の代謝活性を直接測定することができます。
図3. ATPベースの生存率アッセイの原理
この方法は細胞のエネルギー代謝に関する知見を提供し、生理学的および病理学的状態に関する研究において有用です。しかしながら、ATPアッセイは技術的に複雑であり、正確な操作と専門的な分析が必要です。結果は細胞の種類や実験条件によって異なる場合があり、包括的な評価が必要です。
5. フローサイトメトリー：生存率を分析するための多パラメータツール
フローサイトメトリーは、細胞のハイスループットかつ多パラメータ解析を可能にする強力な技術です。細胞のサイズ、粒度、DNA含量、細胞周期の状態、生存率など、豊富な生物学的情報を提供します。細胞生存率は、通常、選択的蛍光色素を用いて評価されます。
生存率検出に用いられる一般的な蛍光色素：
ヨウ化プロピジウム (PI):生細胞の損傷されていない膜を貫通することはできませんが、死細胞に入り込み、核酸に結合して赤色蛍光を発します。
カルセイン-AM:生細胞膜を透過し、細胞内エステラーゼによって緑色蛍光のカルセインに変換されます。
7-AAD: PI と同様に、死細胞を明るい赤色の蛍光で染色しますが、生細胞によって排除されます。
フローサイトメトリーは、迅速な検出、高スループット、複数のパラメータを同時に分析できるなどの利点があります。数千個の細胞を数分で分析し、包括的なデータを生成できます。しかし、正確な結果を得るには、高価な機器、熟練した操作、そして特定の複雑なサンプルや細胞の種類に合わせた慎重な最適化が必要です。
結論
上記の方法は、細胞の生存率と増殖を評価するために最も広く用いられている手法の一つです。それぞれに独自の原理、利点、そして限界があります。実際の研究や医療応用においては、具体的な目的、細胞の種類、そして実験条件に基づいてアッセイを選択する必要があります。多くの場合、複数の方法を組み合わせることで、細胞生存に関する最も信頼性が高く包括的な知見が得られます。
製品概要
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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100トン/500トン/1000トン |
40203ES60/76/80 |
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1000トン/10000トン |
40202ES80 /92 |
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10 mL/100 mL/10×100 mL |
40210ES10 /60/80 |