エクソソームは、細胞から活発に分泌される膜結合小胞であり、通常、直径30～150nmです。タンパク質、DNA、コーディングRNAおよびノンコーディングRNA、脂質など、宿主細胞由来の様々な生体分子を含んでいます。エクソソームは、腫瘍の形成、増殖、転移、そして疾患の進行と密接に関連しています。そのため、腫瘍の診断と治療における研究のホットスポットとなっています。
標識エクソソームは、受容体細胞への取り込み研究や小動物における生体内分布イメージングに広く用いられています。では、エクソソームを高効率に蛍光標識するための重要なヒントは何でしょうか？
Q1: エクソソームの標識にはどのような蛍光染料を使用できますか?
親油性膜色素は、エクソソームの簡便な標識によく用いられます。これらの色素は、長い脂肪族末端をエクソソーム膜のリン脂質二重層に埋め込むことで、強力な蛍光シグナルを発します。
一般的に使用される親油性蛍光プローブには以下のものがあります。
PKH67 （緑; Ex/Em = 490/502 nm）
PKH26 （赤; Ex/Em = 551/567 nm）
DiO （緑; Ex/Em = 484/501 nm）
DiI （赤; Ex/Em = 549/565 nm）
DiD （遠赤外線; Ex/Em = 644/663 nm）
DiR （近赤外線; Ex/Em = 750/780 nm）
適切な色素を選択することは、標識を成功させる上で不可欠です。DiOとDiIは細胞との共培養実験に適していますが、DiRはエクソソームの生体内イメージングに適しています。
Q2: 適切な標識濃度をどのように決定するのでしょうか?
DiOおよびDiIは、細胞膜標識には通常1～5μMで使用されますが、エクソソーム標識にはこの濃度は比較的低すぎます。高い標識効率を確保するには、 DiO、DiI、DiRの濃度を100μMにすることを推奨します。この濃度は効率的な標識を促進し、エクソソームに対して無毒性であり、色素の分子サイズが小さいため除去が容易です。
Q3: エクソソームの標識には固定が必要ですか?
固定は不要です。生細胞標識と同様に、DiOなどの親油性色素は、固定や透過処理を必要とせずにエクソソームに直接使用できます。
Q4: エクソソームの量に応じて推奨される色素量はどれくらいですか?
染料を 100 μM の作業溶液として調製したら、エクソソームタンパク質含有量に基づいて次のガイドラインに従います。
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エクソソームタンパク質量 |
染料作業溶液の量 |
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10～200μg |
50μL |
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200～500μg |
100μL |
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500～1000μg |
200μL |
Q5: 標識付けのインキュベーション条件は何ですか?
エクソソームを染料とともに室温または 37°C で 30 分間インキュベートします。
Q6: 標識付け後に遊離/非結合色素を除去するにはどうすればよいでしょうか?
インキュベーション後、洗浄のために標識液量の少なくとも50倍量のPBSを加えます。以下のいずれかの方法で余分な色素を除去します。
超遠心分離： 120,000 × gで1時間遠心分離する。
限外濾過： 100 kDaまたは10 kDaの限外濾過チューブを使用します。100 kDaフィルターの孔径は約10 nmで、遊離色素は通過しますが、標識エクソソームは保持されます。遠心分離後、内側のチューブを新しい遠心チューブに逆さまにし、再度遠心分離して標識エクソソームを回収します。
Q7: ラベリングの成功をどのように評価しますか?
標識されたエクソソームは、蛍光顕微鏡またはin vivoイメージングシステムを用いて検出できます。標識に成功したエクソソームは強い蛍光を発しますが、標識に失敗したエクソソームはシグナルがほとんどまたは全く得られません（下図参照）。
Q8: 標識されたエクソソームはどのように保存しますか?
すぐに使用しない場合は、標識されたエクソソームは-80℃で保存できます。短期保存の場合は4℃でも問題ありません。
結論
エクソソームの標識は比較的簡単です。標識効率を決定づける重要な要素は、色素の選択と濃度です。適切な色素を選択し、最適な濃度を使用することで、標識結果を大幅に向上させることができます。これらのFAQが、若手研究者の皆様がエクソソームの標識を成功させ、関連する課題を解決する一助となることを願っています。適切なツールと方法を用いることで、研究はより効率的かつ効果的になります。
参考文献
[1] 李寧.エクソソーム膜蛍光分析およびイメージング法の研究[D]. 大連理工大学, 2020. DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2020.004153.
[2] Ma W、Zhang X、Liu Y、et al. 創傷治癒のためのFe-MSC由来ナノベシクルカプセル化ポリドーパミン装飾マイクロニードル. Adv Sci (Weinh) . 2022;9(13):e2103317. doi:10.1002/advs.202103317
[3] Lobb RJ、Becker M.、Wen SW、et al.細胞培養上清およびヒト血漿からの最適化されたエクソソーム分離プロトコル。J Extracell Vesicles . 2015;4(1):27031。
製品概要
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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HieffTM Quickエクソソーム分離キット（血清/血漿用） |
30ml |
41202ES30 |
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Hieff TMエクソソームトラッカーキット（緑色蛍光用） |
20μl |
40781ES20 |
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DiO（DiOC18(3)） |
10mg/25mg |
40725ES10/25 |
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DiI（DiIC18(3)） |
10mg |
40726ES10 |
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DiD過塩素酸塩（DiIC18(5)） |
25mg |
40758ES25 |
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DiRヨウ化物（DiIC18(7)） |
25mg |
40757ES25 |