ミトコンドリアは、オートファジー、カルシウム恒常性、免疫応答、シグナル伝達、アポトーシスなど、様々な細胞プロセスに関与しています。ミトコンドリアの恒常性は、細胞の形態、量、細胞内分布、そして機能の調節において重要な役割を果たしています。
ミトコンドリアはエネルギー産生の際に、ミトコンドリア内膜に電気化学ポテンシャルを蓄えます。膜を挟んだプロトンやその他のイオンの非対称分布により、ミトコンドリア膜電位（MMP）が生成されます。この電位は電気的性質を持つため、生細胞内のミトコンドリアは特定の色素を選択的に保持することができます。そのため、膜電位依存性蛍光色素は、生細胞イメージングにおいてミトコンドリアを標識するために一般的に用いられています。
では、様々な色素やプローブをどのように選択すればよいのでしょうか？また、異常な標識結果にはどのように対処すればよいのでしょうか？実際の経験に基づくと、標識結果に最も影響を与える要因は、細胞の種類、蛍光プローブの選択、実験手法などです。
それぞれの側面を詳しく調べてみましょう。
Q1: ミトコンドリアの形態はさまざまな細胞タイプで同じですか?
下図（図1）は、30 nMで標識した様々な細胞タイプのミトコンドリアの共焦点顕微鏡画像を示しています。 TMRM （テトラメチルローダミンメチルエステル）:
A. HMEC-1 (ヒト微小血管内皮細胞) : ミトコンドリアは楕円形で高度に分岐しており、代謝活性が高いことを示しています。
B. マウスのアストロサイト：ミトコンドリアは豊富かつ均等に分布しており、高いエネルギー需要を反映しています。
C. INS-1 膵臓 β 細胞: ミトコンドリアは密集しており、インスリン分泌時のエネルギー需要と一致しています。
D. 新鮮に分離したラット肝細胞：ミトコンドリアはより拡散して分布しており、肝細胞の複雑な代謝機能に関係している可能性があります。
図 1. 30 nM TMRM で標識された 4 種類の異なる細胞タイプのミトコンドリアの共焦点画像。
図2は、 MitoTracker Deep Redを用いてHepG2細胞（上）、 HeLa細胞（中）、 COS-7細胞（下）のミトコンドリアを標識したものです。細胞種間で形態学的差異が明確に示されています。
図 2. 100 nM MitoTracker Deep Red で標識した 3 種類の細胞におけるミトコンドリアの共焦点画像。
Q2: ミトコンドリア染色にはどのような種類があり、どのように分類されますか?
一般的なミトコンドリアプローブには以下のものがあります:
MitoTrackerシリーズ
ミトフルオールシリーズ
JC-1 / JC-9 / JC-10
ローダミン123
TMRM
ミトコンドリア膜電位（MMP）に対する感受性によって大まかに分類できます。
1. MMP非感受性プローブ:
MitoTracker Green FM ：この色素は、ミトコンドリアタンパク質のシステイン残基上のチオール（-SH）基と反応し、共有結合標識を可能にします。膜電位に依存しないため、ミトコンドリアの形態（融合や分裂など）や量の研究に適しています。ただし、染色後に固定するとシグナルが失われるため、固定はできません。
MitoTracker Deep Red FM : MMP 非感受性ですが、染色後に4% PFA で固定し、冷アセトンで透過処理することができます。
2. MMP感受性プローブ:
ローダミン123 ：正に帯電し、負に帯電した活性ミトコンドリアに蓄積します。アポトーシス中のミトコンドリアの脱分極により蛍光が著しく低下するため、アポトーシス研究でよく使用されます。染色後は固定できません。
MitoTracker Red CMXRos ：細胞透過性があり、活性ミトコンドリアに選択的に集積し、呼吸細胞でのみ蛍光を発します。ミトコンドリアの酸化還元状態を反映し、代謝活性や酸化ストレスの評価に適しています。本プローブは染色後に固定・透過処理が可能です。
Q3: 固定後にミトコンドリアの標識付けはできますか?
いいえ、 MitoTracker や TMRMなどの生細胞ミトコンドリアプローブは、固定細胞や組織サンプルには適していません。
固定サンプルの場合、免疫蛍光アッセイではTOM20やGrp75などのミトコンドリア特異的抗体を使用することをお勧めします。
Q4: 作業濃度は染色結果に影響しますか?
はい。細胞の種類や状態によって、色素濃度とインキュベーション時間は異なります。 標識効率に大きく影響します。低濃度使用時によくある問題には以下が含まれます。
蛍光が弱い、または全くない
標識に成功した細胞の割合が低い
ミトコンドリア色素の濃度を高めると、多くの場合、標識結果が大幅に改善されます。
Q5: 染色した生細胞をさらに培養することはできますか？
一般的には、はい、ただし数時間だけです。
蛍光プローブの性質上、シグナル強度は時間の経過とともに減衰します。よく見られる現象の一つとして、ミトコンドリアの明瞭な構造が失われ、結果として拡散した点状のシグナルが生じることが挙げられます。
Q6: 生細胞ミトコンドリア染色はパラフィン切片や凍結切片に使用できますか?
パラフィン切片：固定および包埋工程により膜電位が破壊されるため、生細胞染色は使用できません。代わりに、ミトコンドリア抗体を用いた免疫検出が推奨されます。
凍結切片：場合によっては、 ミトトラッカー ディープレッド サンプルの品質に応じて試行できます。
Q7: 単離したミトコンドリアを生細胞染色で標識することはできますか?
はい、膜電位が損なわれていない新鮮に分離されたミトコンドリアは、次のような生細胞プローブを使用して標識できます。
MitoTrackerシリーズ
ローダミン123
JC-1 / JC-9 / JC-10
しかし、凍結または以前に保存されたミトコンドリア 膜の完全性が損なわれることが多いため、適していません。
参考文献
Long Dan、Zhou Yanni、Feng Li、他. 細胞および組織における2つのミトコンドリア標識法の比較.四川大学医学部誌（医学版） , 2020, 51(3): 388–392. DOI: 10.12182/20200560205
Cottet-Rousselle C, Ronot X, Leverve X, Mayol JF. 蛍光プローブを用いたミトコンドリアの細胞計測学的評価. Cytometry A. 2011年6月;79(6):405–25. doi: 10.1002/cyto.a.21061. PMID: 21595013
製品概要
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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1mg/5mg |
40705ES03/08 |
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1mg/5mg |
40707ES03/08 |
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JC-1ミトコンドリア膜電位アッセイキット |
100トン |
40706ES60 |
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ローダミン123 |
5 mg / 25 ミリグラム |
40712ES08 /25 |