Zhang A, Pan S, Zhang Y, et al. リアルタイムイメージング、光熱療法／光力学療法、ナノザイム酸化療法のための炭素-金ハイブリッドナノプローブ. Theranostics. 2019;9(12):3443-3458. 2019年5月24日発行. doi:10.7150/thno.33266(IF:8.063)
研究者、特に細胞生物学や薬理学の研究者は、文献を読む際に、フローサイトメトリーによる美しいアポトーシスの図に頻繁に遭遇します。様々な検出法の中でも、アネキシンVをベースとしたフローサイトメトリーアッセイは、細胞アポトーシスの評価に最も広く用いられているものの一つです。
しかし、多くの人にとってフローサイトメトリーは依然として分かりにくい技術です。アポトーシス解析を加えると、予想外の奇妙なプロットが出てくることがよくあります。「こうした奇妙な結果をどう解決すればいいのか、あるいはプロトコルを最適化すればいいのか？」と疑問に思うかもしれません。
もう心配する必要はありません。アネキシン V アポトーシスアッセイでよくある問題の包括的なリストをまとめました。
運用セクション
1. Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出の原理は何ですか?
初期アポトーシスでは、ホスファチジルセリン（PS）が細胞膜の内層から外層へと移行します。FITC（緑色蛍光）標識されたアネキシンVは、外部に放出されたPSに特異的に結合し、初期アポトーシス細胞であることを示します。赤色蛍光を発するDNA結合色素であるヨウ化プロピジウム（PI）は、後期アポトーシス細胞や壊死細胞など、膜が損傷した細胞のみを透過します。PIは488、532、または546nmのレーザーで励起できます。
2. Annexin V/PI アポトーシス キットは種特異的ですか?
いいえ。アネキシンVは種を超えて保存されているPSに結合します。したがって、キットは種に依存しません。
3. EDTA を含むトリプシンの使用はアポトーシスの検出に影響しますか?
はい。アネキシンVの結合はCa²⁺依存的です。EDTAはCa²⁺をキレート化し、アネキシンVとPSの相互作用を阻害し、アッセイ結果に悪影響を及ぼします。
4. 細胞が GFP を発現している場合、どのアポトーシス キットを使用すればよいですか?
FITC標識のアネキシンV（GFPと同じ発光）は避けてください。スペクトルの重複を最小限に抑えるため、PE、APC、またはAlexa Fluor 647で標識されたキットを使用してください。
5. 血液サンプルから血小板を除去する必要があるのはなぜですか?
血小板にはPSが含まれており、アネキシンVと結合して誤った結果をもたらす可能性があります。PSを除去することで干渉を回避できます。
6. アネキシン V 染色試薬を取り扱う際にはどのような予防措置を講じるべきですか?
アネキシンV色素は光に敏感です。染色とインキュベーションは暗所で行い、染色後1時間以内にサンプルを分析すると最良の結果が得られます。
結果セクション
1. 蛍光補正を正しく行うにはどうすればよいでしょうか?
理論的には、X 平均と Y 平均は等しくなるはずです (図に示すように) が、実際には、蛍光の漏れを防ぐことが目標です。
たとえば、FITC のみで染色された細胞は、PI 陽性象限には表示されないはずです。
推奨されるコントロール:
非染色コントロール: FSC/SSC および電圧設定を調整して集団を定義します。
単一染色コントロール: アポトーシスを誘導し、Annexin V-FITC と PI で個別に染色します。
二重染色サンプル: コントロールから最適化されたパラメータを使用してデータを取得します。
2. 対照群で偽陽性が発生する原因は何ですか?
補正が不十分なため、蛍光が重なっています。適切なコントロールを使用して再調整してください。
過剰合流細胞や飢餓状態の細胞は、自発的にアポトーシスを起こす可能性があります。
過剰なトリプシン処理や機械的な損傷により膜の完全性が損なわれる可能性があります。
薬剤または細胞の自己蛍光による蛍光の妨害。
染色後または長期の薬物治療後の遅延フローサイトメトリー。
3. 治療群ではなぜ陽性シグナルが見られないのでしょうか?
薬剤の濃度または治療期間が不十分な可能性があります。
上清中のアポトーシス細胞は見逃されます。必ず上清を含めてください。
操作上の誤り: 染料の追加を忘れた、または染色後に染料を洗い流した。
キットの劣化または不適切な保管。陽性コントロールを使用してキットの機能性を確認してください。
4. 核シグナルのみが陽性で、アネキシン V が陰性の場合はどうなりますか?
細胞の健康状態が悪い。健康な対数増殖期の細胞を使用してください。
過度なピペッティングや乱暴な取り扱いは避けてください。機械的な損傷を避けるため、優しく取り扱ってください。
5. アネキシン V のみが陽性で、核染色が陽性でない場合はどうなるのでしょうか?
核染色（PIまたは7-AAD）が漏れている可能性があります。適切な染色液で染色をやり直してください。
細胞は初期アポトーシス状態にある可能性があります。薬剤処理条件を調整し、顕微鏡で観察してください。
6. 細胞集団が明確に分離されていない場合はどうなるでしょうか?
細胞の自己蛍光がシグナルに干渉する可能性があります。重複しない蛍光色素を含むキットを選択してください。
細胞の状態が悪いと非特異的なPS露出を引き起こす可能性があります。穏やかな解離酵素を使用してください。 アキュターゼ。
まとめ：
実験前に、細胞に自己蛍光があるかどうかを確認し、適切なアポトーシス検出キットを選択してください。 AccutaseなどのEDTAフリー解離酵素を使用してください。染色の省略を避け、染色後の細胞洗浄は行わないでください。分析中は、電圧と補正が正しく設定されていることを確認し、キットの性能を確認するために必ず陽性コントロールを使用してください。処理群ごとに適切な濃度勾配と時間勾配を設計し、最適な実験条件を決定してください。
こうすることで、あなたのアポトーシス プロットは、一流ジャーナルに掲載されるものと同じくらい出版に値するものになります。
製品概要
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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20T/50T/100T |
40302ES20/50/60 |
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20T/50T/100T |
40303ES20/50/60 |
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20T/50T/100T |
40304ES20/50/60 |
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20T/50T/100T |
40305ES20/50/60 |
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アネキシン V-PE/7-AAD アポトーシス検出キット |
20T/50T/100T |
40310ES20/50/60 |