1. 技術原理の紹介
1) 生きた動物における生物発光イメージング（BLI）では、小型哺乳類においてレポーター遺伝子（ルシフェラーゼなど）を発現させます。発現したルシフェラーゼは、酸素、Mg²⁺、およびATPの存在下で、基質であるルシフェリンの酸化を触媒します。この化学反応により、化学エネルギーの一部が可視光として放出されます。放出された光は、高感度CCDカメラで捉えられ、画像が生成されます。生物発光信号の強度は、標識された細胞数と直線的に相関します。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、様々な遺伝子プロモーターの下に配置することでレポーターとして機能し、標的遺伝子の発現または調節をモニタリングすることができます。
図1: ルシフェラーゼによって触媒される生物発光反応
2) 生物発光は化学発光の一種です。ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化反応の際、広い可視スペクトル（460～630 nm、平均約560 nm）の光が放出されます。哺乳類では、ヘモグロビンが可視光の大部分、特に青緑色の領域を吸収します。水と脂質は主に赤外光を吸収しますが、赤色から近赤外領域（590～800 nm）の吸収は比較的低いです。その結果、赤方偏移した生物発光（>600 nm）は、散乱による損失はあるものの、組織への透過性が向上し、高感度CCDデバイスで検出できます。
図2: 生体内イメージングの原理、機器、結果
2. 生体内イメージングの応用
腫瘍学: がんモデルにおける腫瘍の成長、転移、治療反応を迅速かつ非侵襲的に定量化できます。
創薬: 抗腫瘍薬の効能研究、薬物動態、細胞標識、遺伝子発現および機能研究、アポトーシス追跡に適用されます。
3. 生物発光と蛍光イメージングの比較
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生物発光 |
蛍光 |
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利点 |
(1) 高感度 (2) 鮮明な信号で高速イメージング (3) 生体内で10²個程度の細胞を検出 |
（1）多様な色素とタンパク質が利用可能 （2）マルチプレックス化が可能 （3）FACSソーティングに適用可能 |
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デメリット |
（1）信号が弱いため高感度CCDが必要 （2）精密機器が必要 （3）標的細胞または遺伝子に標識を付けなければならない |
（1）非特異的なバックグラウンド蛍光により感度が低下する（2）生体内での検出限界は約10⁶個である（3）外部励起光が必要である（4）生体内での定量化は困難である |
4. ルシフェリンカリウム塩、ナトリウム塩、遊離酸の違い
ホタルルシフェラーゼの基質であるルシフェリンは、遊離酸またはカリウム/ナトリウム塩として入手可能です。主な違いは以下のとおりです。
溶解性：塩形態は水溶性です。ナトリウム塩は約100 mg/mL、カリウム塩は約60 mg/mLで溶解します。遊離酸は水に溶けにくいですが、弱塩基性の重炭酸塩溶液には溶けます。
毒性: 塩の形態は水溶性が高く毒性が低いため、生体適合性が高く、体内での使用に便利です。
パフォーマンス：画像化結果に有意差は認められませんでした。生体内実験ではカリウム塩がより一般的に使用されています。
5. 体内の微弱な生物発光はどのように検出されるのでしょうか?
低い生物発光信号の検出を確実にする主な要因は 2 つあります。
超高感度冷却 CCD カメラは、-105°C という低温でも動作し、最小限の光子放出を検出できます。
遮光イメージングチャンバーにより、周囲の光や背景放射を除去してきれいな信号をキャプチャします。
6. ラットは生体内イメージングに使用できますか?
はい。成体マウス、ラット、そして胎児では組織透過性に差がありますが、可視光は3～4cmの組織を透過します。ラットを用いた生体内イメージングは、多くの研究で成功しています。
7. 冷却 CCD は動物の体温に影響を与えますか?
いいえ。冷却システムは CCD センサーに限定されており、撮像室内の周囲温度には影響しません。撮像室内の周囲温度は室温に保たれます。
8. GFPに対するルシフェリンベースのイメージングの利点
ルシフェラーゼを用いたイメージングは、赤方偏移した光を発し、GFPの緑色蛍光に比べて組織への浸透性が約100倍優れています。酵素反応は高い特異性と信号対雑音比を実現しますが、GFPは外部励起を必要とするため、皮膚や毛皮からの非特異的な自己蛍光が生じる可能性があります。そのため、GFPはin vitro検出に適しており、ルシフェラーゼはin vivoアプリケーションに最適です。
9. 従来の方法に対する生物発光イメージングの利点
生物発光イメージングは、腫瘍転移、遺伝子治療、疾患発症、幹細胞追跡、白血病モデルなどの研究において、感度の向上とリアルタイム追跡を可能にします。薬剤の有効性評価においては従来の方法よりも優れており、トランスジェニック疾患モデルを用いた迅速なスクリーニングを可能にします。
10. ルシフェラーゼで幹細胞を標識するにはどうすればいいですか?
2つの主な方法:
トランスジェニックマウスモデルにおいて、ルシフェラーゼを駆動する恒常活性プロモーターを用いる。骨髄から造血幹細胞を採取し、別のマウスに移植することで、in vivoでの増殖、分化、遊走を観察する。
あるいは、レンチウイルスベクターを使用して、生体内での追跡のために神経幹細胞にルシフェラーゼを導入することもできます。
11. ルシフェリン注入後、いつイメージングを実施すればよいですか？信号はどのくらい持続しますか？
腹腔内注射後、最大の生物発光シグナルは10〜15分後に現れ、しばらく安定し、20〜30分頃に減少し始めます。
3 時間までにルシフェリンは排出され、信号は検出できなくなります。
12. ルシフェリンを注入するにはどうすればいいですか？方法の違いは何ですか？
ルシフェリンは、 腹腔内（IP）または尾静脈（IV） 注射：
IP 注入: 拡散が遅くなり、信号の発生が遅れますが、信号の持続時間は長くなります。
IV 注射: 拡散が速く、信号はすぐに現れますが、信号持続時間は短くなります。
典型的な投与量は 150 mg/kg ; 20 gのマウスの場合、これはルシフェリン約3 mgに相当します。
製品概要
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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100mg / 500mg / 1g |
4070 2 ES0 1 /0 2/03 |
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100mg / 500mg / 1g |
4070 1 ES0 1 /0 2/03 |
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100mg / 500mg / 1g |
4070 3 ES0 1 /0 2/03 |
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10 T/100 T/1000 T |
11402ES10/60/80 |
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100 T/1000 T/10×100 T/10 T |
11413ES60/81/80/10 |