Annexin V-EGFP/PI 細胞アポトーシス検出キットは、EGFP 標識 Annexin V をプローブとして使用し、初期細胞アポトーシスの発生を検出します。
検出原理は以下のとおりです。通常の生細胞では、ホスファチジルセリン（PS）は細胞膜の内側に位置していますが、初期アポトーシス細胞では、PSが細胞膜の内側から細胞膜の表面に反転し、細胞外環境に露出しています。アネキシンVは、分子量35～36 kDaのCa ²⁺依存性リン脂質結合タンパク質であり、PSに高い親和性で結合します。ホスファチジルセリンは、細胞外に露出したホスファチジルセリンを介して、初期アポトーシス細胞の膜に結合することができます。
さらに、生存している初期細胞を壊死細胞や後期アポトーシス細胞と区別するために、ヨウ化プロピジウム（PI）が添加されています。PIは核酸色素であり、正常細胞や初期アポトーシス細胞の細胞膜は透過できませんが、後期アポトーシス細胞および壊死細胞の細胞膜は透過し、核を赤色に染めます。そのため、アネキシンVをPIと組み合わせると、PIは生細胞（アネキシンV ^- /PI ^- ）および初期アポトーシス細胞（アネキシンV ⁺ /PI ^- ）から排除されました。後期アポトーシス細胞および壊死細胞は、EGFPとPIの両方に対して二重陽性でした（アネキシンV ⁺ /PI ⁺ ）。
このキットはフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡に適しています。

製品コンポーネント

配送と保管

コンポーネントはアイスパックとともに出荷され、-20°C で光を避けて保管し、1 年間は凍結と解凍の繰り返しを避けてください。
【注意事項】：短期間に繰り返し使用する必要がある場合は、4℃で遮光保存すれば半年間は保存可能です。

注意事項

1) アポトーシスは急速なプロセスであるため、サンプルは染色後 1 時間以内に分析することをお勧めします。
2) 接着細胞の場合、消化は重要なステップです。EDTAはアネキシンVとPSの結合に影響を与える可能性があるため、消化液にEDTAを使用しないでください。
3) アポトーシスと細胞周期を同時に検出するなどの細胞固定には、アネキシンV-FITCではなくアネキシンV-EGFPを使用する必要があります。EGFPは固定中に変性し、蛍光励起能力を失うためです。細胞は固定前にアネキシンV-FITCでインキュベートし、結合していないアネキシンV-FITCは結合バッファーで洗い流しました。固定中に細胞透過性が上昇すると、アネキシンVに結合して結果に影響を及ぼす可能性のある細胞片が生じるためです。
4) 血液サンプルの場合は、必ず血小板を除去してください。血小板にはPSが含まれており、アネキシンVと結合して結果に影響を与える可能性があります。血小板は、EDTAを含む緩衝液を用いて200gで遠心分離することで洗い流すことができます。
5) カバーを開ける前に試薬を軽く遠心分離し、カバーを開けるときに液体が飛び散るのを防ぐため、カバーの内壁の液体をチューブの底に捨ててください。
6) Annexin V-EGFPおよびPIは光に敏感な物質ですので、操作中は光を避けてください。
7) 研究目的のみに使用してください。

説明書

実験設計
ブランクチューブ: アネキシン V-EGFP および PI 染色溶液を含まないネガティブコントロール細胞を電圧調節に使用しました。
単一染色チューブ: 補償を調整するために、Annexin V-EGFP のみを添加した陽性対照細胞を使用しました。
検出チューブ：細胞はアネキシンV-EGFPおよびPI染色溶液で処理されました。実験データは、ブランクチューブと単一染色チューブのパラメータを調整することで取得されました。
1.1 サンプル染色
1) 懸濁細胞：細胞を4℃で5分間、300 gで遠心分離して回収した。
接着細胞：EDTAを含まないトリプシンで消化した後、4℃で5分間、300 gで遠心分離して細胞を採取しました。偽陽性を防ぐため、トリプシン消化時間は長すぎないようにする必要があります。
2) 細胞を予め冷却したPBSで2回（各回300 g）洗浄し、4℃で5分間遠心分離した。
3) 細胞を1×結合緩衝液で再懸濁し、濃度を1～5×106/mLに調整した。
4) 100 μLの細胞懸濁液を5 mLフローサイトメトリーチューブに加え、5 μLのアネキシンV-EGFPを加え、細胞を混合して室温で5分間光の下でインキュベートした。
5) 10μlのPI溶液と400μlのPBSを加え、すぐに染色を行った。
[注意]：フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを検出する場合、PI は時間に大きく影響され、時間が長すぎると PI 染色が増加するため、フローサイトメトリーは 1 時間以内に完了する必要があります。
1.2 フローサイトメトリー分析
EGFPの最大励起波長は488 nm、最大発光波長は507 nmでした。PI-DNA複合体の最大励起波長は535 nm、最大発光波長は615 nmでした。解析にはCellQuestなどのソフトウェアを使用し、EGFPを横軸、PIを縦軸とする2色ドットプロットを描画しました。サンプルごとに10,000イベントを収集します。典型的な実験では、細胞は3つのサブグループに分けられ、生細胞は非常に低強度の背景蛍光のみを示し、初期アポトーシス細胞は強い緑色蛍光のみを示し、後期アポトーシス細胞は緑色と赤色の蛍光の二重染色を示します。