説明
Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、WST-8（2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩）試薬をベースにした、高速で高感度な検出キットです。 WST-8はMTTの改良試薬で、ミトコンドリア内の脱水素酵素によって水溶性の高い橙黄色のホルマザンに還元されます。 生成されるホルマザンの量は生細胞数に比例します。 マイクロプレートリーダーで検出される450nmでのホルマザンのOD値は、生細胞数を間接的に示すことができます。 このキットは、薬物スクリーニング、細胞増殖および細胞毒性アッセイ、腫瘍薬物感受性試験、生物学的因子の活性検出に広く使用されています。
CCK-8法の利点
1. CCK-8 法と他の細胞増殖/毒性検出法の比較。
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検出方法 |
MTT法 |
XTT法 |
WST - 1つの方法 |
CCK 8法 |
|---|---|---|---|---|
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ホルマザン製品の水溶性 |
低（有機溶媒を加えて溶解してからテストする必要があります） |
高い |
高い |
高い |
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製品特性 |
粉 |
溶液2本 |
解決 |
溶液1本 |
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使用方法 |
溶液に混ぜて使用する |
溶液は使用直前に調製されました。 |
箱から出して |
箱から出して |
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検出感度 |
高い |
非常に高い |
非常に高い |
高い |
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検出時間 |
長さ |
短い |
短い |
最短 |
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検出波長 |
560～600 nm |
420～480 nm |
420～480 nm |
430～490 nm |
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細胞毒性 |
高い毒性、細胞形態の完全な消失 |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
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試薬の安定性 |
一般的な |
低い |
一般的な |
高い |
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バルクサンプルテスト |
実現可能 |
適切な |
適切な |
適切な |
2. フェノールレッドおよび血清は CCK-8 の検出を妨げません。
3. CCK-8試薬の細胞毒性は非常に低いため、CCK-8試薬を添加した後、異なる時間にマイクロプレートリーダーで繰り返し読み取ることで、最適な測定時間を決定できます。
配送と保管
製品は乾燥した暗い場所に-25〜-15℃で2年間保存できます。
予防
1. 最初の実験では、播種する細胞の最適な数とCCK-8試薬の最適なインキュベーション時間を決定することをお勧めします。
2. 可能であれば、マルチチャンネルピペットを使用して、反復ウェル間のばらつきを減らしてください。気泡はOD測定に影響を及ぼすため、実験中は気泡が入らないようにしてください。CCK-8試薬を添加する際は、培養培地に直接添加するのではなく、培養プレートの壁際に添加することをお勧めします。
3. 白血球の場合はより長い培養時間が必要になる場合があります。
4. 標準96ウェルプレートを使用する場合、播種する細胞数は1,000個/ウェル（100μL）以上です。白血球の検出感度は比較的低いため、少なくとも2,500個/ウェル（100μL）以上を播種することをお勧めします。24ウェルまたは6ウェルプレートを使用する場合は、各ウェルの細胞数を計算し、適切な量のCCK-8試薬を添加します（添加するCCK-8試薬の量は、プレートの各ウェルの培養液量の10%です）。
5. 450 nm フィルターが使用できない場合は、430 ～ 490 nm の吸光度を持つフィルターを使用できますが、450 nm フィルターを使用すると最高の検出感度を実現できます。
6. 培地中のフェノールレッドの吸光度はブランク群の吸光度を差し引くことで除去できるため、フェノールレッドは測定に影響を与えません。
7. 安全と健康のため、実験を行う際は白衣と使い捨て手袋を着用してください。
説明書
I. 標準曲線を作成する
1. 細胞懸濁液を調製し、細胞密度を決定し、細胞を播種します。
2. 細胞を培養培地で一定の比率（1:2 比率など）に従って順次希釈し、細胞濃度勾配を形成します。通常、細胞濃度勾配は 3 ～ 5 個で、各濃度ごとに 3 ～ 6 個のウェルが複製されます。
3. 細胞を播種後、2～4時間培養して接着させます。その後、CCK-8試薬を添加し、一定時間インキュベートした後、OD値を測定し、細胞数をX軸、OD値をY軸として標準曲線を作成します。この標準曲線に基づいて、未知のサンプル中の細胞数を決定することができます（この標準曲線を使用するには、実験条件が一定である必要があります）。
II. 細胞生存率アッセイ
1. 96ウェルプレートに細胞（100 μL/ウェル）を播種し、インキュベーター（37℃、5% CO2 ）で一定時間プレインキュベーションする。
2. 各ウェルに CCK-8 試薬 10 μL を加え (ウェルに気泡が入ると OD の読み取りに影響するため、気泡が入らないように注意してください)、軽く混ぜます。
3. プレートをインキュベーターに入れて 1 ～ 4 時間インキュベートします。
4. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定します。
5. OD値をすぐに測定しない場合は、各ウェルに0.1 M HCl溶液または1% w/v SDS溶液を10μLずつ加え、プレートを覆い、遮光して室温で保存してください。吸光度値は24時間以内に変化しません。
III. 細胞増殖および細胞毒性アッセイ
1. 96ウェルプレートに細胞（100 μL/ウェル）を播種し、インキュベーター（37℃、5% CO2 ）で24時間プレインキュベーションする。
2. 試験対象物質の異なる濃度を 10 μL ずつプレートに加えます。
3. プレートをインキュベーターに入れて、一定期間（6、12、24、48 時間など）インキュベートします。
4. 各ウェルに CCK-8 試薬 10 μL を加え (ウェルに気泡が入ると OD の読み取りに影響するため、気泡が入らないように注意してください)、軽く混ぜます。
5. プレートをインキュベーターに入れて 1 ～ 4 時間インキュベートします。
6. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定します。
7. OD値をすぐに測定しない場合は、各ウェルに0.1 M HCl溶液または1% w/v SDS溶液を10μLずつ加え、プレートを覆い、遮光して室温で保存してください。吸光度値は24時間以内に変化しません。
注：物質が酸化性または還元性である場合、CCK-8試薬を添加する前に、古い培地を新しい培地に交換してください（古い培地を除去し、細胞を新しい培地で2回洗浄した後、新しい培地を添加する）。これにより、物質の影響を排除できます。物質自体が吸光度にわずかな影響を与える場合は、培地を交換する必要はなく、物質を含むブランク群の吸光度値を差し引くことで、物質の影響を排除できます。
計算式
細胞生存率 = [(AC) /(BC)] ×100%
阻害率 = [(BA) /(BC)] ×100%
A: 実験群の吸光度（細胞、CCK-8試薬、被検物質を含む培養液の吸光度）
B: 対照群の吸光度（細胞を含む培養液、CCK-8試薬の吸光度）
C: ブランク群の吸光度（CCK-8試薬を含む培養液の吸光度）
引用
文書:
引用と参考文献:
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