トランスフェクションは、細胞を用いた実験において最も広く用いられている技術の一つです。様々な方法を用いて外来性の核酸を細胞に導入することで細胞の特性を変化させ、遺伝子機能やタンパク質発現の研究を可能にします。トランスフェクションの方法は、そのメカニズムの違いから、物理的方法（例：エレクトロポレーション、遺伝子銃、マイクロインジェクション）、化学的方法（例：リン酸カルシウム、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー）、生物学的方法（例：レトロウイルス、アデノウイルス）の3種類に大別されます。
研究室で最も一般的に使用されるトランスフェクション試薬として、使用する際にどのような注意を払うべきでしょうか？ リポソームベースのトランスフェクション試薬?
図1: リポソームを介したDNAトランスフェクションのメカニズム
試薬セクション
Q1. リポソームベースのトランスフェクション試薬の動作原理は何ですか？
リポソームは正電荷を帯びており、静電相互作用によって核酸と結合し、核酸-リポソーム複合体を形成します。これらの複合体は細胞膜に吸着され、膜融合またはエンドサイトーシスによって細胞内に侵入します。最終的に、DNAはエンドソームから細胞質または核へと放出され、そこで転写および発現されます。
Q2. リポソームベースのトランスフェクション試薬は保存時に凍結する必要がありますか?
いいえ、凍結しないでください。リポソームベースのトランスフェクション試薬は4℃で保管してください。リポソームの酸化はトランスフェクション効率に悪影響を及ぼす可能性があるため、長時間または繰り返し空気にさらさないでください。
運用セクション
Q3. トランスフェクション複合体を調製する際に血清を存在させることができますか？
いいえ。トランスフェクション複合体を調製する際は、無血清培地（通常はOpti-MEM）の使用をお勧めします。血清中の負に帯電したタンパク質は、リポソームと核酸の結合を阻害し、複合体の形成に影響を与える可能性があります。
Q4. トランスフェクション中に抗生物質を添加できますか？
トランスフェクションプロセスのどの段階でも抗生物質を添加してはいけません。トランスフェクションによって細胞膜の透過性が高まり、抗生物質の細胞毒性効果が増強され、細胞死につながる可能性があります。
Q5. トランスフェクションプロセスを終了する必要がありますか?
いいえ。リポソーム複合体は最大6時間安定しています。トランスフェクション前に培地を交換していない場合は、細胞増殖に必要な栄養素を確保するために、4～6時間後に新鮮な培地に交換することをお勧めします。ただし、トランスフェクション前に培地を更新した場合は、それ以上の培地交換は不要です。
実験の最適化のヒント
図2：Hieff Trans試薬を用いたリポソームベースのトランスフェクションのワークフロー
Q6. リポソームベースのトランスフェクションで重要な考慮事項は何ですか？
細胞播種密度: DNA トランスフェクションの場合は 90%～95% の集密度、RNA トランスフェクションの場合は 30%～50%。
高純度 DNAによりトランスフェクション効率が向上します。
無血清培地を使用して、DNA とトランスフェクション試薬の両方を希釈します。
トランスフェクション中は培養培地に抗生物質を入れないでください。
試薬は 4°C で保管し、繰り返し長時間空気にさらさないようにしてください。
試薬を初めて使用する際は、 DNAと試薬の比率を最適化してください。一般的なDNAとトランスフェクション試薬の比率は1:2～1:3です。
Q7. 複数のプラスミドを同時トランスフェクトできますか？DNAとRNAを同時トランスフェクトできますか？
はい、複数のプラスミドを共トランスフェクションすることは可能ですが、パイロット実験をお勧めします。通常、DNAの総量は一定に保ち、各プラスミドの比率は、サイズ、構造、および目的の発現に基づいて調整する必要があります。DNAとsiRNAの共トランスフェクションも可能ですが、その場合、siRNAのトランスフェクション効率が低下する可能性があります。
Q8. トランスフェクション中の細胞の状態に関して何か要件はありますか？
生存率が90%を超える健全な細胞を使用してください。細胞はトランスフェクションの24時間前に継代し、回復を促してください。継代回数の過多を避け、マイコプラズマ、真菌、細菌などの汚染物質がないことを確認してください。常に新鮮な増殖培地を使用してください。
Q9. プラスミドのサイズはリポソームベースのトランスフェクション効率に影響しますか?
はい。プラスミドのサイズが大きくなると、トランスフェクション効率は低下する傾向があります。最適な結果を得るには、プラスミドのサイズは理想的には10kb未満に抑える必要があります。プラスミドのサイズが大きくなると、トランスフェクション効率が大幅に低下する可能性があります。
製品概要
|
製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
|
0.5 mL/1 mL/5 mL |
40802ES02/03/08 |
|
|
0.5 mL/1 mL/5 mL |
40808ES02/03/08 |
|
|
500μL/5×500μL |
40804ES76/86 |
|
|
0.5 mL/1 mL |
40806ES02/03 |
|
|
25μL/100μL/1mL |
40810ES25/01/03 |
|
|
1.5 mL/10 mL/100 mL |
40820ES04/10/60 |
|
|
Hieff Trans ™懸濁液無細胞リポソームトランスフェクション試薬 |
100μL/0.5mL/1.0mL/5×1mL |
40805ES01/02/03/08 |