I. トランスフェクションの原理
Q1: トランスフェクションとトランスダクションの違いは何ですか?
- トランスフェクション：化学的方法（リポソーム、カチオン性ポリマー）、物理的方法（エレクトロポレーション、マイクロインジェクション）、または非ウイルス生物学的方法によって、裸の核酸またはキャリア複合体を形成した核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド）を真核細胞に導入すること。ウイルスの複製機構は関与しない。
- 伝達:ウイルスの自然な感染メカニズムに依存した、ウイルスベクター (レンチウイルス、アデノウイルス、AAV など) を介した遺伝子送達。
Q2: 安定トランスフェクションと一過性トランスフェクションの主な違いは何ですか?
- 一過性トランスフェクション：導入された核酸はゲノムに組み込まれません。発現は一時的（通常24～96時間）であり、細胞分裂中に核酸が分解または希釈されるにつれて徐々に失われます。
- 安定導入：核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、発現は多数の細胞分裂を経て維持されます。通常、選択（例：抗生物質耐性マーカー）が必要です。
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特徴 |
一過性トランスフェクション |
安定トランスフェクション |
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遺伝子統合 |
DNAは宿主ゲノムに組み込まれない |
DNAは宿主ゲノムに組み込まれる |
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表現持続時間 |
短期（数時間から数日） |
長期的（数週間から数年） |
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表現レベル |
最初は非常に高いことが多いが、その後は低下する |
最初は低いかもしれないが、時間が経つにつれて安定する |
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選択 |
選択手順は不要 |
安定したクローンを分離するには選択（抗生物質耐性など）が必要 |
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アプリケーション |
短期研究、プロモーター活性アッセイ、RNA干渉スクリーニングのためのタンパク質生産 |
長期的な機能研究、安定したタンパク質発現、生産のための細胞株の作成 |
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結果が出るまでの時間 |
迅速 – 1～3日で結果が出る |
遅い – 安定したラインを確立するには数週間かかる場合があります |
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料金 |
より低い |
高い（選択、スクリーニング、検証のため） |
Q3: リポソーム、カチオンポリマー、リン酸カルシウムのトランスフェクション方法の違いは何ですか?
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特徴 |
リポソームトランスフェクション |
カチオンポリマートランスフェクション |
リン酸カルシウムトランスフェクション |
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機構 |
脂質小胞が細胞膜と融合し、核酸を放出する |
正に帯電したポリマーは核酸を凝縮し、エンドサイトーシスを促進する。 |
リン酸カルシウム - DNA複合体は細胞表面に沈殿し、エンドサイトーシスを介して細胞内に侵入する。 |
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細胞型の適合性 |
広範囲（接着細胞と浮遊細胞） |
幅広い（特に扱いにくい細胞の種類に効果的） |
限定的（HEK293、HeLaでは有効） |
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効率 |
多くの細胞株で高い |
高いが、毒性は低いことが多い |
可変（pHと温度に敏感） |
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毒性 |
中程度（脂質組成による） |
低～中程度 |
高い（感受性細胞株では細胞死を引き起こす可能性がある） |
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料金 |
中程度から高い |
適度 |
低い |
II. 適切なトランスフェクション試薬の選択
Q4. 実験に最適なトランスフェクション試薬を選択するにはどうすればよいですか？
次の要素を考慮してください。
- 細胞の種類: 初代細胞、幹細胞、または細胞株 (一部の試薬は特定の細胞の種類に最適化されています)。
- 核酸の種類: DNA、mRNA、siRNA、または CRISPR コンポーネント (試薬は特定の分子に特化している場合があります)。
- 最終用途: 一時的発現、安定した統合、ノックダウン、遺伝子編集。
- 毒性感受性: 毒性の低い試薬は、感受性細胞 (例: 一次ニューロン) にとって重要です。
- 互換性 - 血清含有培地、下流アッセイと互換性があります。
- スループット: ハイスループットスクリーニングでは、スケール変更が容易な試薬が必要になる場合があります。
Q5: 一般的な市販のトランスフェクション試薬の特徴は何ですか?
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試薬の種類 |
ブランド例 |
強み |
制限事項 |
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脂質ベース |
リポフェクタミンTM 、FuGENE TM 、jetPEI TM |
高効率、幅広い適用性 |
費用がかかる可能性がある |
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ポリマーベース |
PEI、TurboFect TM 、 JetPEI |
コスト効率が高く、拡張性に優れている |
より高い細胞毒性 |
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エレクトロポレーション |
Lonza Nucleofector TM 、Neon TM |
トランスフェクションが難しい細胞に適しています |
特殊な機器が必要 |
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リン酸カルシウム |
古典的な方法 |
低コスト |
可変的な再現性 |
III. トランスフェクションプロトコル
Q6. 初代細胞へのトランスフェクションにはどのようにアプローチすればよいですか?
初代培養細胞は感受性が高く、取り込み効率が低い傾向があります。ヒント:
- 初代細胞用に検証された試薬を使用してください。
- 細胞の合流性を最適化します（通常は60～80％）。
- 試薬の毒性を最小限に抑えます（投与量を減らし、曝露時間を短縮します）。
- トランスフェクション中に血清濃度を下げます（または血清に適合した試薬を使用します）。
- トランスフェクション複合体への曝露時間を最小限に抑える（4～6時間）
- トランスフェクションが難しいタイプの場合はエレクトロポレーションを検討してください。
Q7. DNA、mRNA、siRNAのトランスフェクションの違いは何ですか？
DNA：転写には核への進入が必要。タイミングは細胞周期に依存する可能性がある。
mRNA：細胞質に到達するだけで発現が開始し、ゲノムへの組み込みリスクがありません。発現は1～4時間で開始し、1～4日間持続します。トランスフェクションが難しい細胞、短期発現、プロモーター非依存の研究に最適です。
siRNA：配列特異的なmRNA分解を媒介する小さな二本鎖RNA。発現ノックダウンは数時間で発現する可能性がある。インキュベーション時間が短く（4～24時間）、標的配列を特異的に必要とする。遺伝子サイレンシングに用いられる。
Q8. siRNAのトランスフェクション効率を高めるにはどうすればよいですか？
- 高品質の二重精製 siRNA を使用します。
- 試薬と siRNA の比率を最適化します。
- 細胞ストレスを避けるために血清に適合した試薬を使用してください。
- qPCR またはウェスタンブロットで遺伝子ノックダウンを確認します。
Q9. プラスミドDNAにはサイズ制限がありますか？
リポソーム試薬は 2 kb から約15 kbまでうまく機能しますが、 DNA サイズが 15kb を超えると効率が低下します。
Q10. 複数のプラスミドを共トランスフェクション用に混合するにはどうすればよいですか？
- 総 DNA 量をキットの最大値内に維持します。
- 各プラスミドは全体の10%以上。
- モル比を調整します。
- レポータープラスミドは、 「スケルチング」を避けるために 1:5 から 1:10 に減らすことができます。
IV. トランスフェクション結果の分析
Q 11 : トランスフェクション効率を評価するにはどうすればいいですか?
一般的な方法は次のとおりです:
- 蛍光レポーター（例：GFP、mCherry） - 蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで陽性細胞を数えます。
- qPCR – 標的遺伝子の発現変化を定量化します。
- ウェスタンブロット – タンパク質発現の変化を測定します。
- 機能アッセイ - トランスジーンまたはノックダウンの下流効果を測定します。
Q12: トランスフェクション効率が低い原因は何ですか? また、トラブルシューティング方法を教えてください。
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潜在的な原因 |
トラブルシューティング |
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細胞の健康状態が悪い |
新鮮な継代細胞を使用し、過剰な集積や老化を避けてください。 |
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試薬と核酸の比率が正しくありません |
滴定実験により比率を最適化します (例: 試薬: DNA の場合 1:1 ～ 3:1)。 |
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高い毒性 |
試薬濃度を下げるか、インキュベーション時間を短くしてください。 |
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不適切な細胞集密度 |
50～80%の合流度に調整します（細胞の種類によって異なります）。 |
Q 13 : トランスフェクション後に細胞が死ぬのはなぜですか? またそれを防ぐにはどうすればよいですか?
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原因 |
典型的な症状 |
予防/解決策 |
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試薬の毒性 |
12～24時間以内に細胞死が起こり、細胞が丸くなり、剥離する |
試薬の量を減らし、低毒性の試薬を選択し、細胞の種類に適した試薬を使用してください。 |
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過剰な核酸 |
成長の遅れ、形態異常、アポトーシスの増加 |
DNA/RNAの投与量を減らし、目的の発現に必要な最小限の量を使用する |
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トランスフェクション前の細胞の健康状態が悪い |
ベースライン生存率が低い、細胞密度が不均一、接着力が弱い |
健康で活発に分裂している細胞（70～90%の集密度）を使用する。集密度が高すぎる細胞やストレスのかかった細胞は避ける。 |
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過酷なトランスフェクション条件 |
突然の剥離、膜の膨疹 |
無血清培養は最小限の時間に制限し、速やかに完全培地に戻す |
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免疫反応の活性化 |
アポトーシスの増加、免疫遺伝子の上方制御 |
化学的に修飾された核酸（例：mRNAにはシュードウリジン）を使用する；適合する場合は免疫応答阻害剤との併用治療を行う |
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物理的ストレス（電気穿孔法、マイクロインジェクション） |
即時の細胞膨張、溶解、または空胞化 |
エレクトロポレーション電圧/パルスを最適化し、マイクロインジェクション中の取り扱いを慎重に行う |
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汚染 |
トランスフェクション条件とは無関係に徐々に細胞が死滅する |
マイコプラズマ/細菌汚染を検査し、清潔な培養物と交換する |
Q 14. siRNAトランスフェクション後、いつノックダウンアッセイを行うべきですか？
- mRNA: 24～48時間。
- タンパク質：48～72時間。
- FAM-siRNA の蛍光は 6 時間以内に細胞質斑点として観察されます。
Q 15 : 安定したトランスフェクションを確認するにはどうすればいいですか?
- 抗生物質（例：ネオマイシン耐性遺伝子の場合はG418）を使用して2〜3週間細胞を選択し、統合されていない細胞を除去します。
- DNA の統合を確認するために、レポーター (GFP など) の長期発現またはゲノム PCR によって検証します。
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関連製品
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名前 |
カタログ番号 |
サイズ |
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40801ES01/40801ES04 |
100μL/1.5mL |
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40816ES02/03 |
100mg/1g |
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40820ES04/10/60 |
1.5 mL/10 mL/100 mL |
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40823ES03/10/60 |
1mL/10mL/100mL |
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|
40824ES10 |
10mL |
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参考文献
[1]Kim, TK & Eberwine, JH, 2010.「哺乳類細胞へのトランスフェクション：現在と未来」分析化学および生分析化学、397(8)、pp.3173-3178。
[2]パーカー、AL、ニューマン、C.、ブリッグス、S.、シーモア、L.、シェリダン、PJ、2003年。「非ウイルス遺伝子送達：分子医学における技術と意義」分子医学専門家レビュー、5(22)、pp.1-15。
[3] Jordan, M. & Wurm, FM, 1996. 哺乳類細胞のトランスフェクション：リン酸カルシウム沈殿形成に影響を与える重要なパラメータの最適化. Nucleic Acids Research, 24(4), pp.596-601.
[4]Godbey, WT, Wu, KK & Mikos, AG, 1999.「遺伝子送達におけるポリ（エチレンイミン）とその誘導体」制御放出ジャーナル、60(2–3)、pp.149–160。
[5]セミザロフ, D., フロスト, L., サーシー, A., クローガー, P., ハルバート, DN & フェシック, SW, 2003.「遺伝子発現シグネチャーによる短鎖干渉RNAの特異性の決定」米国科学アカデミー紀要、100(11)、pp.6347-6352。
[6]Felgner, PL, Gadek, TR, Holm, M. et al., 1987. 「リポフェクション：高効率な脂質媒介DNAトランスフェクション法」米国科学アカデミー紀要、84(21)、pp.7413-7417。
[7]van der Aa, MA, Huth, US, Häfele, SY et al., 2007.「カチオン性ポリマー-DNA複合体のカベオラを介した細胞内への取り込みは、COS-7細胞への遺伝子導入において極めて重要な役割を果たす。」製薬研究、24(8)、pp.1590-1598。
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