マクロファージ除去：方法、メカニズム、応用

1. マクロファージクリアランスの概要

マクロファージは、表皮、角膜、関節腔といった無血管部位を含む、ほぼすべての臓器に存在するユニークな免疫細胞です。組織の恒常性維持、宿主防御、そして疾患の進行において極めて重要な役割を果たすため、「マクロファージ枯渇」はマクロファージ生物学研究における最も重要なアプローチの一つです。

マクロファージを選択的に除去することで、研究者は生理学的および病理学的条件下でのマクロファージの機能についてより深い知見を得ることができます。マクロファージ欠損の遺伝子ノックアウトモデルは存在しますが、コストと時間がかかり、技術的にも困難です。一方、「クロドロネートリポソーム」（確立されたマクロファージ除去試薬）は、生体内でのマクロファージ除去において、簡便かつ経済的で広く採用されているツールです。肝臓、脾臓、肺、末梢血など、複数の組織からマクロファージを除去する効果があり、現在の研究において最も実用的なアプローチとなっています。

2.マクロファージ除去：方法

表1. マクロファージ除去法の概要

方法	原理	利点	制限事項
遺伝子モデル（ノックアウトマウスまたはトランスジェニックマウス）	マクロファージ特異的遺伝子の選択的欠失（例：CSF1Rノックアウト、Cre-loxシステム）	永久枯渇、細胞型特異性	費用がかかり、時間がかかり、柔軟性が限られており、発達上の補償を引き起こす可能性がある
クロドロネートリポソーム	マクロファージによる貪食 → 細胞内クロドロネート放出 → アポトーシス	便利で、再現性があり、広く使用されており、注射経路で臓器を標的にすることが可能	一時的な枯渇のため、繰り返し投与する必要がある
化学物質の枯渇（例：リポソームビスホスホネート、毒素）	マクロファージによって選択的に取り込まれる毒性化合物	迅速なクリアランス、アクセス可能	リポソームと比較した場合、オフターゲット効果、選択性が限られている
抗体介在性枯渇（例：抗CSF1R、抗F4/80）	抗体は生存シグナルを遮断したり、細胞死を誘導したりする	標的型で、他の治療法と併用可能	高価で、完全な枯渇が達成されない可能性がある
放射線治療または局所治療	放射線または局所照射により特定の組織のマクロファージが破壊される	組織特異的な研究に有用	侵襲的、非選択的、限定的な適用

3.クロドロネートリポソームのメカニズム

クロドロネートリポソームは、膜透過性のないビスホスホネートであるクロドロネートをリン脂質二重層に封入することで開発されました。体内に投与されると、リポソームは選択的にマクロファージによって貪食されます。

マクロファージ内部では、リソソームホスファターゼがリポソーム膜を徐々に分解し、クロドロネートを細胞質へ放出します。細胞内に蓄積したクロドロネートは「不可逆的な損傷とアポトーシス」を引き起こします。マクロファージが死滅すると、残留クロドロネートが放出され、最終的には尿中に排泄されます。非貪食細胞にはほとんど影響がありません。このメカニズムにより、他の免疫細胞集団に広範囲にわたる悪影響を与えることなく、マクロファージのみを選択的に標的とすることができます。

図 1. クロドロネートリポソーム複合体（左）とマクロファージ枯渇メカニズムの模式図（右）。

4.クロドロネートリポソームの使用に関する一般的なプロトコル

実験の詳細は標的臓器、動物モデル、研究設計によって異なりますが、クロドロネートリポソームを使用したマクロファージ枯渇研究のほとんどは、次の一般的な手順に従います。

準備

使用前にクロドロネートリポソームを室温まで温めてください。
バイアルを静かに反転させて混ぜます。リポソームの安定性を維持するために、激しく振らないでください。

動物の選択

健康なマウスまたはラットを使用し、グループ間で年齢と体重が一定であることを確認します。
動物を実験グループとコントロールグループ（例：PBS リポソームコントロール）にランダムに分けます。

管理

標的臓器に応じて注射経路を選択します。
全身的枯渇（脾臓、肝臓、血液）の場合はIVまたはIP投与。
肺マクロファージの場合は鼻腔内または気管内投与。
脳ミクログリアのための脳室内投与。
組織特異的な標的（関節、リンパ節）のための局所注射。
参照表に従って推奨用量を投与してください。

監視

注射後、動物にストレスや不快感の兆候がないか観察します。
研究期間中、体重、活動、全体的な健康状態を追跡します。

検証:

フローサイトメトリー、免疫組織化学、または組織染色 (例: F4/80、CD68 マーカー) によってマクロファージの減少を確認します。
特異性を保証するために、常に適切なコントロールと比較します。

繰り返し投与（必要な場合）

長期研究では、マクロファージの枯渇を維持するために 3 ～ 4 日ごとに注射を繰り返します。

表2. マウスおよびラットにおけるマクロファージ枯渇に対するクロドロネートリポソームの参照投与量

標的臓器/細胞の種類	実験方法	参照用量と投与経路	注記
脾臓/赤髄マクロファージ	単一の枯渇	200 µL/マウス（IVまたはIP）	短期クリアランスに効果的
	長期的な枯渇	最初はマウス1匹あたり200 µL、その後は3日ごとに200 µL（IVまたはIP）	持続的な枯渇を維持する
肝臓/クッファー細胞	単一の枯渇	200 µL/マウス（IVまたはIP）	体系的研究でよく使用される
	長期的な枯渇	最初はマウス1匹あたり200 µL、その後は3日ごとに200 µL（IVまたはIP）	長期枯渇戦略
肺/肺胞マクロファージ	併用投与	150～200µL IV + 50µL 気管内または鼻腔内	二重ルート配送で効率が向上
リンパ節	局所注射	100～200µL/マウス	投与方法は様々であり、文献を参照のこと
脳 / ミクログリア	脳室内注射	10 µL/マウス; 50 µL/ラット	選択的なミクログリアの枯渇を可能にする

5. マクロファージ除去の応用

クロドロネートリポソームを用いたマクロファージ除去は、生物医学研究における強力なツールとなり、科学者が健康状態と疾患におけるこれらの細胞の多様な役割を解明することを可能にしました。主な応用分野は以下の通りです。

免疫学と感染症
マクロファージを除去することで、病原体認識、抗原提示、サイトカイン産生におけるマクロファージの役割を解明することができます。このアプローチは、細菌、ウイルス、寄生虫感染モデルにおいて、宿主防御機構の研究に広く用いられています。

がん研究
腫瘍関連マクロファージ（TAM）は、血管新生、転移、そして免疫抑制を促進することが知られています。TAM除去研究は、マクロファージがどのように腫瘍の増殖を補助し、その除去が免疫療法の成果をどのように向上させるかを明らかにするのに役立ちます。

炎症と自己免疫疾患
マクロファージは、関節炎、動脈硬化症、炎症性腸疾患などの疾患において慢性炎症を引き起こします。クロドロネートリポソーム治療により、研究者はマクロファージ由来メディエーターが疾患の重症度にどのように影響するかを研究することができます。

組織の再生と修復
マクロファージは組織修復において二重の役割を果たします。死細胞の除去を促進すると同時に、再生を調整する役割も担っています。肝損傷、肺線維症、創傷治癒のモデルにおいて、炎症と治癒のバランスを理解するには、マクロファージ枯渇実験が不可欠です。

神経科学
脳内に常在するマクロファージであるミクログリアは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患に関与していると考えられています。クロドロネートリポソームの局所投与は、ミクログリアを選択的に除去することを可能にし、神経炎症や神経細胞の生存へのミクログリアの寄与に関する知見をもたらします。

名前	カタログ番号	サイズ
クロドロネートリポソーム（アムステルダム自由大学より）	40337ES08/10	5mL / 10mL
コントロールリポソーム（PBS）	40338ES08/10	5mL / 10mL