1. マクロファージ除去の概要
マクロファージは、表皮、角膜、無血管性関節など、体中のあらゆる臓器に存在する唯一の細胞です。生体内でのマクロファージの生物学的役割を研究するための重要な方法の一つは、マクロファージ除去です。マクロファージを除去することで、研究者は病態下におけるマクロファージの機能を包括的に理解することができます。
現在、マクロファージ除去の主なアプローチとしては、マクロファージ欠損動物モデルの作製と、クロドロネートリポソームなどの化学薬剤の使用が挙げられます。しかし、マクロファージ欠損動物モデルの作製には費用と時間がかかります。クロドロネートリポソーム（マクロファージ除去剤）は、肝臓、脾臓、肺、血液など、様々な組織や臓器におけるマクロファージを効果的に除去するための、現在最も成熟した、簡便で費用対効果の高いツールです。これは、現在までに最も広く使用されているマクロファージ除去法です。
2. マクロファージ除去剤の原理
クロドロネートはリン脂質二重層の水相に封入され、クロドロネートリポソームを形成します。クロドロネートはリン脂質二重層を自由に通過できません。体内に注入されると、クロドロネートリポソームはマクロファージによって貪食されます。マクロファージのリソソーム内では、ホスファターゼがリポソームを分解し、クロドロネートが徐々に細胞内に放出されます。クロドロネートが一定濃度に達すると、不可逆的な損傷が生じ、アポトーシスが誘発されます。死細胞から放出されたクロドロネートは尿中に排泄されます。
3. マクロファージ除去剤の推奨投与方法
最適な投与量はマウスの系統によって若干異なる場合があります。以下の表に基づいて投与量を最適化してください。
表1. C57マウスにおけるマクロファージ除去投与方法
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管理 |
詳細 |
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方法 |
腹腔内注射、静脈注射、鼻腔内点滴など |
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投与量（C57マウス） |
単回投与量：150～200μL/マウス（20～25g）；複数回投与量：150～200μL/マウス（20～25g）を3～7日ごとに投与。 （注：投与量と投与間隔はマウスの系統や標的組織によって異なり、固定値ではありません。パイロット実験または関連文献に従って調整してください。） |
4. マクロファージマーカー
マクロファージには多くのサブタイプがあり、それぞれのマーカーも異なります（表2参照）。さらに、マクロファージマーカーは組織や臓器によって異なります（表3参照）。マクロファージ除去実験を行う前に、文献を精査し、標的組織におけるマクロファージの表面マーカーを特定し、フローサイトメトリー解析に最適なマーカーを選択することをお勧めします。
表2. マクロファージのサブタイプのマーカー
参考文献：Klopfleisch R. マウスモデルにおける生体材料に対するマクロファージ反応 - 表現型、機能、マーカー. Acta Biomater. 2016年10月1日;43:3-13. doi: 10.1016/j.actbio.2016.07.003. Epub 2016年7月6日. PMID: 27395828.
表3. さまざまな組織におけるマクロファージマーカー
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マクロファージの種類 |
組織 |
マーカー |
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脂肪組織マクロファージ |
脂肪組織 |
CD45+、F4/80+、PPARγ+ |
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クッファー細胞 |
肝臓 |
B7-1/CD80^low/-、CD11b/インテグリンαM^low、CD68/SR-D1+、F4/80^high、ガレクチン3/Mac-2+、PPARδ+、シグレック-1/CD169+ |
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肺胞マクロファージ |
肺胞 |
CD11b/インテグリンαM^低/-、CD11c^高、CD68/SR-D1+、CD200R1+、DEC205/CD205^int、デクチン1+、F4/80^低、ガレクチン3/Mac-2+、MARCO+、MHCクラスII^低、MMR/CD206^高、PPARγ+、シグレックF^高 |
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間質性肺マクロファージ |
肺 |
CD11b/インテグリンαM^int、CD11c-、CD68/SR-D1+、CD200R1^+/-、F4/80+、MHCクラスII^+/-、SiglecF- |
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骨髄マクロファージ |
骨髄 |
CD169+、ER-HR3+、F4/80+、TRAP-、VCAM1/CD106+ |
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腸管マクロファージ |
消化管 |
CD11b/インテグリンαM+、CD11c^low/int、CX3CR1^high、F4/80+、FcγRI/CD64^+、MHCクラスII^high |
5. マクロファージ枯渇の文献例
研究1
マウス系統: C57BL/6J
投与経路：腹腔内注射
採取部位：末梢血
投与量: 200μL/マウス
抗体: F4/80
方法：クロドロネートリポソームを用いてマクロファージ除去モデルを構築し、マウス1匹あたり200μLを腹腔内投与した。投与24時間後、末梢血マクロファージ数をフローサイトメトリーで測定した。
結果：
図 1. 腹腔内注射後のマクロファージの減少。
参考文献：Xiong X, Chen S, Shen J, et al. 大麻はCNR2を介してT細胞におけるJAK/STATシグナル伝達を阻害し、抗腫瘍免疫を抑制する。Signal Transduct Target Ther . 2022;7(1):99. doi:10.1038/s41392-022-00918-y (IF: 18.187)
研究2
マウス系統: メス C57BL/6J
投与経路：腹腔内注射
採取部位：腹膜洗浄液
投与量：0日目、3日目、6日目に15 mg/kg
抗体：CD11b、F4/80二重陽性
方法：6週齢の雌C57BL/6Jマウスに、クロドロネートリポソーム（15 mg/kg）または対照空リポソーム（200 μL PBS溶液）を0日目、3日目、6日目に腹腔内投与し、マクロファージを枯渇させた。最終投与から3日目または6日目に、1×10^6 BMDMを100 μL PBSに溶解したものを静脈内投与し、マクロファージを再構成した。腹腔洗浄液中のマクロファージの枯渇および再構成はフローサイトメトリーを用いて解析した。
結果：
図 2. リポソーム注入後のマクロファージ枯渇および再構成のフローサイトメトリー分析。
参考文献：Zhang Z, Chen C, Yang F, et al. イタコン酸は抗菌性自然免疫を促進するリソソーム誘導剤である。Mol Cell . 2022. doi:10.1016/j.molcel.2022.05.009 (IF: 17.970)
研究3
マウス系統: C57BL/6J
投与経路：静脈内注射
採取部位：血液、乳腺
投与量: 200μL/マウス
抗体: F4/80
方法：授乳中のマウス1匹あたり200μLのクロドロネートリポソーム（0.15～0.2 mL/25 g）を静脈内投与し、血中および乳腺中のマクロファージを減少させた。投与後24、48、72時間にフローサイトメトリーを実施し、乳腺マクロファージ数を測定した。
結果
（a）血液分析装置によって検出された血液中の単球の割合の変化。
（b）フローサイトメトリーで検出された乳腺マクロファージの割合の変化。
参考文献：Cai J, Peng J, Zang X, et al. 乳腺白血球支援ナノ粒子輸送による標的乳微量ミネラル送達の促進. Adv Sci (Weinh) . 2022;9(26):e2200841. doi:10.1002/advs.202200841 (IF: 17.521)
研究4
マウス系統: C57BL/6
投与経路：腹腔内注射
採取部位：末梢血
投与量: 200μL/マウス
抗体: F4/80
方法：3日目に、クロドロネートリポソーム（200μL）を腹腔内投与し、マクロファージを枯渇させた。枯渇の確認にはフローサイトメトリーを用いた。
結果：
図 4. 免疫細胞枯渇のフローサイトメトリー分析。
参考文献：Yu X, Long Y, Chen B, et al. PD-L1/TLR7デュアルターゲットナノボディ薬物複合体は、宿主発現PD-L1バイアス依存的に腫瘍免疫原性を高め、強力な腫瘍退縮を促進する。J Immunother Cancer . 2022;10(10):e004590. doi:10.1136/jitc-2022-004590 (IF: 12.469)
6. マクロファージ除去における一般的な問題
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問題 |
解決 |
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コントロールグループを設定するにはどうすればいいですか? |
空のリポソームをネガティブコントロールとして使用します。 |
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この薬剤はin vitro枯渇に使用できますか? |
はい、しかしin vivoでの使用に適しています。in vitroでは放出されたクロドロネートは培養液中に残留しますが、in vivoでは半減期が短く、腎臓で排泄されます。in vitroで蓄積した遊離クロドロネートは、ゆっくりと細胞内に侵入する可能性があります。 |
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静脈注射後の急死の原因は？ |
（1）室温で使用してください。（2）使用前によく混ぜてください。（3）動物の汚染や感染を避けてください。 |
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さまざまな臓器/組織への注射部位、投与量、タイミング、頻度をどのように決定するのでしょうか? |
特定の実験設計に基づいて、文献を参照するか、独自のスキームを設計します。 |
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IV 注射後、脾臓/肝臓の ED1+ 細胞が完全に枯渇しないのはなぜですか? |
ラットの成熟マクロファージはED1+/ED2+ですが、貪食機能を持たない前駆細胞はED1+/ED2-です。クロドロネートリポソームはED2+細胞を完全に除去できますが、ED1+細胞は部分的にしか除去できません。除去効率は前駆細胞と成熟細胞の比率に依存します。 |
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最適ではない枯渇の理由は何ですか? |
（1）各バッチについてクロドロネート濃度および汚染物質がないことを確認する。 （2）4～8℃で保管し、凍結または30℃を超える加熱を避ける。 （3）受領後3ヶ月以内に使用する。 |
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IV注射の量を増やすことはできますか？ |
IV 投与量は体重 10 g あたり 0.1 mL 以下、腹腔内注射量は若干多くても可、皮下注射量は部位の容量によって異なります。 |
関連製品
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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5mL/10mL |
40337 ES08/10 |
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5mL/10mL |
40338ES 08/10 |