アポトーシスの過程では、活性化エンドヌクレアーゼがヌクレオソーム間のゲノムDNAを切断します。一般的に用いられるTUNELアッセイ（TdT介在dUTPニックエンドラベリング）は、アポトーシス後期における核内のDNA断片化を検出します。
原理としては、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（TdT）によって触媒され、断片化された DNA の 3' ヒドロキシル末端を蛍光タグ付き dUTP で標識し、顕微鏡下で可視化できるようにします。
Q1: TUNEL アッセイにおける一般的な検出方法は何ですか?
TUNEL 検出には 2 つの一般的な方法があります (下の表を参照)。
最初の方法では、TdT を使用して蛍光標識 dUTP を DNA 切断の 3'-OH 末端に組み込み、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡 (例: FITC 標識を使用) を使用して蛍光を直接観察します。
2つ目の方法は、ビオチンまたはジゴキシゲニン標識dUTPをTdTに取り込み、HRP標識ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体で検出する方法です。発色基質（例：DAB）は、光学顕微鏡で観察可能な褐色沈殿物を生じます。
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検出方法 |
ラベル |
検出装置 |
サンプルタイプ |
特徴 |
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蛍光 |
フルオレセイン-dUTP |
蛍光顕微鏡 |
組織切片、細胞サンプル |
高感度; 光に敏感 |
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発色性 |
ビオチン/ジゴキシゲニン-dUTP + DAB |
光学顕微鏡 |
組織切片 |
安定した信号；3% H₂O₂による内因性ペルオキシダーゼの阻害が必要 |
Q2: TUNEL アッセイで陽性シグナルが出ないのはなぜですか?
陽性シグナルの欠如は、サンプル内の DNA の劣化、検出試薬内の TdT 酵素の不活性化、蛍光 dUTP の劣化、不十分な透過処理、または過剰な洗浄によって発生する可能性があります。
推奨事項:
- サンプルの完全性とアッセイの機能性を確認するために、陽性コントロール (DNase I 処理サンプルなど) を含めます。
- 試薬の有効性を確認し、期限切れの製品の使用は避けてください。
- プロテアーゼ K 濃度（通常 10～20 μg/mL）を最適化し、室温で 15～30 分間インキュベートします。
- 洗浄回数と洗浄時間を減らしてください。洗浄手順中はシェーカーを使用しないでください。
Q3: 核の外側に非特異的染色があるのはなぜですか?
非アポトーシス領域における非特異的染色（核染色と重複しない）は、以下の原因によって生じる可能性があります。
- 壊死細胞におけるランダムなDNA断片化、
- 組織の自己分解、
- TdT または蛍光 dUTP の濃度が高すぎる、あるいは反応時間が長すぎる。
緩和戦略:
- TUNEL と H&E 染色などの形態学的手法を組み合わせて核凝縮とアポトーシス小体を特定し、アポトーシスと壊死を区別します。
- 処理時間を最小限に抑え、新鮮な組織を迅速に固定します。
- 非特異的なシグナルを減らすには、TdT と標識された dUTP の濃度を下げるか、反応時間を短縮します。
Q4: 蛍光検出でバックグラウンドが高くなるのはなぜですか？どうすれば改善できますか？
バックグラウンドが高くなる一般的な原因は次のとおりです:
- 検出するには強い露出を必要とする弱い陽性信号、
- 赤血球中のヘモグロビンからの自己蛍光（組織サンプルの場合）またはマイコプラズマによる汚染（細胞サンプルの場合）
- 不十分な洗浄。
解決策:
- 問題がサンプル関連かシステム関連かを識別するために、DNase I 処理済みの陽性コントロールを含めます。
- 自家蛍光については、蛍光チャンネルでブランクの組織切片を確認してください。自家蛍光がある場合は、消光剤を使用するか、自家蛍光スペクトルと重ならない蛍光色素を選択してください。
- マイコプラズマ汚染の場合は、不規則または点状の細胞外蛍光を探し、それに応じて検出/除去を行ってください。
- バックグラウンド蛍光を減らすために、0.05% Tween 20 を含む PBS を使用して洗浄を改善します。
Q5: 組織形態の損傷は TUNEL アッセイの結果にどのような影響を与えますか?
過剰な固定は組織の脆弱性や異常な染色につながる可能性があります。24時間以内に固定することをお勧めします。プロテイナーゼKによる過剰な消化は細胞構造を損傷し、異常な染色パターンを引き起こす可能性があります。
Q6: TUNEL染色は免疫蛍光染色と組み合わせることができますか？組み合わせる場合、推奨される順序は何ですか？
はい、TUNEL染色は免疫蛍光染色と組み合わせることができます。まずTUNEL染色を行い、次に免疫蛍光染色を行うことをお勧めします。
Q7: 染色した細胞や組織サンプルは封入できますか？どのくらいの期間保存できますか？
染色された細胞サンプルの蛍光シグナルは通常1～2日間持続します。組織切片を中性バルサムで封入すれば、数日から数週間蛍光が検出できる場合があります。発色シグナルはさらに長期間保存可能です。
Q8: 染色後の結果はどのように分析すればよいですか?
アポトーシスは、グループ間の TUNEL 陽性細胞の割合を比較することによって分析されます。
アポトーシス率 = TUNEL 陽性細胞 / 総細胞数 (DAPI または PI 染色)。
図1：ソベチロムは小気道上皮細胞（SAEC）におけるブレオマイシン誘導性アポトーシスを減少させる
[注記]：( A) SV群、(B) SS群、(C) BV群、(D) BS群のSAECに対してTUNEL染色を行った。青はDAPI染色された核、緑はTUNEL染色陽性のアポトーシス細胞を示す。スケールバー：100 µm。矢印はTUNEL陽性細胞を示す。(E) TUNEL陽性細胞の割合の定量化。
TUNEL染色でよくある問題については以上です。このガイドが、若手研究者の皆様が同様の問題を効果的に解決する一助となれば幸いです。適切なツールと方法を用いることで、研究の効率は格段に向上します。すべての研究者の皆様の成功と美しい染色結果をお祈りいたします。
参考文献
1. Li Z, Zhang X, Xie S, et al. H3K36me2メチルトランスフェラーゼNSD2は精子形成におけるエピジェネティックなリプログラミングを調整する [2022年6月23日、印刷版に先駆けてオンライン出版] Nucleic Acids Res. 2022;50(12):6786–6800. doi:10.1093/nar/gkac533 (IF: 16.971)
関連製品
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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20T/50T/100T |
40306ES20/50/60 |
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20T/50T/100T |
40307ES20/50/60 |
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20T/50T/100T |
40308ES20/50/60 |