活性酸素種（ROS）は、細胞代謝中に生成される酸素含有副産物です。生理条件下では、ROS濃度は厳密に制御されており、正常な細胞シグナル伝達、細胞周期の進行、遺伝子発現、そして恒常性の維持においてシグナル伝達分子としての役割を果たしています。しかし、高濃度のROSは酸化ストレスを誘発し、DNA、膜脂質、タンパク質などの細胞高分子の損傷につながります。この酸化損傷はアポトーシスを誘発する可能性があり、老化、がん、神経変性疾患、糖尿病、炎症にも関連しています。
Q1: 活性酸素種（ROS）とは何ですか？どのような種類がありますか？
ROS とは、過酸化物、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、α 酸素種など、生物の酸素代謝に関連する酸素含有フリーラジカルおよび過酸化物を指します。
例としては、スーパーオキシドアニオン（O₂⁻）、過酸化水素（H₂O₂）、ヒドロキシルラジカル（·OH）、次亜塩素酸（HOCl）、ペルオキシナイトライトアニオン（ONOO⁻）、一酸化窒素（NO）などが挙げられます。
Q2: ROSの検出方法は何ですか?
ROS 検出方法は、直接的なアプローチと間接的なアプローチに分けられます。
① 直接検出では、通常、特定の蛍光プローブが使用されます。
②間接的な検出では、脂質、タンパク質、DNAへの損傷を測定します。
③ あるいは、抗酸化物質のレベルと関連する酵素活性を検出することもできます。
Q3: ROS の直接検出に使用される一般的なプローブは何ですか?
主なタイプは次の 5 つです。
- 総ROS – DCFH-DA（H₂DCFDA）、緑色蛍光
- 総ROS – CellROX Orange、オレンジ蛍光
- スーパーオキシドアニオン - DHE、赤色蛍光
- ミトコンドリアROS – MitoSOX、赤色蛍光
- 一酸化窒素（NO） - DAF-2 DA、緑色蛍光
Q4: DCFH-DA は細菌、真菌、植物に使用できますか?
DCFH-DAは抗体とは異なり、種特異的ではありません。さらに、分子量が小さいため、大腸菌におけるROS検出への応用が文献で検証されています。
Q5: DCFH-DA で検出したときに陽性信号がない場合はどうすればよいですか?
DCFH-DA を使用して ROS を検出したときに、コントロール グループと比較して有意な陽性シグナルまたは陽性細胞集団が観察されない場合は、次のトラブルシューティング ポイントを検討してください。
陽性コントロールの存在と結果を確認します。
総 ROS の一般的な陽性対照としては、過酸化水素 (H₂O₂)、tert-ブチルヒドロペルオキシド (TBHP)、アンチマイシン A (AMA)、ピオシアニンなどがあります。
例えば図Aでは、Huh7細胞の陽性対照としてピオシアニンが使用されており、ROS（DCF）とスーパーオキシド（DHE）の両方のシグナルが増加した[1]。
DCFH-DA の作業濃度とインキュベーション条件を確認します。
DCFH-DAの濃度が低いと、シグナルが弱くなる可能性があります。濃度を1μMから2μMまたは4μMに増やすことができます。典型的なインキュベーション条件は37℃、30分です。
[注記]： 希釈バッファーには、PBS、HBSS、または無血清培地を使用できます。
細胞ベースのアッセイのためのサンプル処理。
DCFH-DA、DHE、または MitoSOX Red のいずれを使用する場合でも、これらのプローブは生細胞の検出を目的としています。
サンプルを固定しないでください。また、染色後に退色防止封入剤を使用したり、カバーガラスをかけたりしないでください。
DCFH-DA染色原理：非蛍光性のDCFH-DAは細胞膜を自由に透過し、細胞内エステラーゼによって加水分解されて非蛍光性のDCFHを生成します。ROS存在下では、DCFHは蛍光性のDCFに酸化され、緑色蛍光の強度はROSレベルと相関します。
Q6: 適切な陽性コントロールを選択するにはどうすればよいですか?
陽性対照は、研究対象となるROSの種類によって異なります。MitoSOXの場合、推奨される陽性対照はMitoPQ、陰性対照はDETA NONOateです。
表1: ROS検出のための陽性対照と陰性対照
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ROSタイプ |
陽性対照 |
ネガティブコントロール |
|
総ROS |
TBHP（tert-ブチルヒドロペルオキシド）、H₂O₂ |
– |
|
ROS; スーパーオキシド |
AMA（アンチマイシンA） |
– |
|
スーパーオキシド; 過酸化水素 |
ピオシアニン |
– |
|
一酸化窒素 |
LPS（リポ多糖類） |
– |
|
ミトコンドリアスーパーオキシド |
ミトPQ |
デタノノエート |
Q7: 核を染色する必要がある場合、どの核染料を使用すればよいですか?
生細胞イメージングには、膜透過性が高いHoechst 33342が推奨されます。DAPIも核染色色素ですが、生細胞観察にはHoechstが適しています。どちらも青色蛍光を発します。
Q8: 検出結果はどのように分析すればよいですか?
異なる実験群間のROSの平均蛍光強度を比較することで、結果を分析できます。さらに、ROS陽性細胞の割合を計算して比較分析することも可能です。
参照
Lynnyk A, Lunova M, Jirsa M, Egorova D, Kulikov A, Kubinová Š, Lunov O, Dejneka A. 低出力レーザー照射によるヒト肝細胞株Huh7のミトコンドリア活性の制御. Biomed Opt Express. 2018年2月21日;9(3):1283–1300. doi:10.1364/BOE.9.001283. PMID: 29541521; PMCID: PMC5846531.
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製品名 |
仕様 |
カタログ番号 |
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1000トン |
50101ES01 |