1.実験材料
- HEK 293 細胞: 細胞密度は 70%～90% に達する必要があります。
- mRNA: EGFP mRNA 、 1000 bp (濃度 ≥ 100 ng/μL)
- Hieff Trans TMブースター DNA&RNA トランスフェクション試薬 (カタログ番号 40801)
- 無血清 Opti-MEM® (血清低減培地)
- 互換性のある組織培養プレートおよび関連する研究室消耗品（例として6ウェルプレートを使用）
2.実験手順
1)トランスフェクション前日の準備
- トランスフェクション当日に 70～90% のコンフルエンスに達する密度で HEK293 細胞を 6 ウェル プレートに播種します。
- ウェルごとに 2 mL の完全 DMEM (10% FBS を含む) を使用します。
- 37℃、5% CO₂で一晩培養する
2)mRNA-試薬複合体を調製する（6ウェルプレートのウェルあたり）
- mRNA を希釈します。2.5 μg の EGFP mRNA を 100 μL の Opti-MEM で希釈します。
[注記]:正確なピペッティングを行うには、mRNA 濃度は 0.1 μg/μL 以上にする必要があります。
- トランスフェクション試薬の希釈:別のチューブで、5 μL のトランスフェクション試薬を 100 μL の Opti-MEM で希釈します。
- mRNA-トランスフェクション試薬複合体の形成: 2 つの溶液を混ぜて軽く混ぜ、室温で 10 ～ 15 分間インキュベートします。
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プレートフォーマット |
ウェルあたりのmRNA量 |
トランスフェクション試薬容量 |
複合体の総量（Opti-MEMまたは無血清培地中） |
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6ウェルプレート |
2～3μg |
4～6μL |
200μL |
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24ウェルプレート |
500～800 ng |
1.5～2μL |
50μL |
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96ウェルプレート |
100～200 ng |
0.3～0.5μL |
20μL |
3)細胞トランスフェクション：細胞への添加
- ウェルから古い培養培地を取り除き、1.8 mL の新鮮な完全 DMEM と交換します。
- 200 μL の mRNA-試薬複合体をウェルに滴下します。
- プレートを軽く揺すりながら均等に広げます。
4)トランスフェクション後の取り扱い
- 細胞を37℃、5% CO₂でインキュベートします。
- 蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション後 18 ～ 24 時間で EGFP の発現を観察します。
- 細胞毒性が観察されない限り、培地の交換は必要ありません。
ヒントと注意事項
- mRNA が高純度であることを確認します (DNase 処理済み、A260/A280 約 2.0)。
- mRNA ストックの凍結融解サイクルの繰り返しは避けてください。
- このプロトコルは、ボリュームを適宜調整することで、他のプレート形式 (24 ウェルまたは 96 ウェルなど) にも適応できます。
3.実験結果
1）HEK293細胞への効率的なmRNA導入
図1 6ウェルプレートで5μLのトランスフェクション試薬を使用して2.5μgのEGFP mRNA（約1000bp）をトランスフェクションし、高いトランスフェクション効率を示しています。
2）幅広い細胞種への効率的なmRNA送達
図2複数の細胞株におけるmRNAトランスフェクション性能
Booster DNA&RNAトランスフェクション試薬とTブランドL*3000を用いた、異なる細胞へのmRNAトランスフェクション。結果は、Boosterの優れたmRNAトランスフェクション効率を示しています。
4. 顧客からのフィードバック
1)高効率293T mRNAトランスフェクション
図3 mRNAトランスフェクション性能
2)高効率HTC116 mRNAトランスフェクション
図4. Booster DNA&RNAトランスフェクション試薬とTブランドL*3000を用いたmRNAトランスフェクション。この結果は、Boosterの優れたmRNAトランスフェクション効率を示しています。
4.よくある質問（FAQ）と解決策
Q1: mRNA トランスフェクションに最適なコンフルエンスはどれくらいですか?
A: 最適な取り込みと細胞の健康を確保するために、トランスフェクション時に細胞は 70%～90% の合流状態である必要があります。
Q2: トランスフェクション中に血清を含む培地を使用できますか?
A: Hieff Trans™ Boosterを含む、ポリマーベースのトランスフェクション試薬のほとんどは血清と互換性があります。ただし、複合体形成中は血清の使用を避け、無血清培地（例：Opti-MEM）を使用してください。
Q3: mRNA ストックの濃度はどのくらいにすべきですか?
A: mRNA濃度は100 ng/μL以上である必要があります。最良の結果を得るには、ピペッティングエラーを最小限に抑えるため、0.5 μg/μL以上の濃度を使用してください。
Q4: 1 ウェルあたりどのくらいの量の mRNA を使用すればよいですか?
A: 6ウェルプレートの場合、1ウェルあたり2～3μgのmRNAを推奨します。他のフォーマットの場合は適宜調整してください（例：24ウェルの場合、約500～800 ng）。
Q5: トランスフェクション後、どれくらいでタンパク質発現を検出できますか?
A: EGFP の発現は通常、トランスフェクション後 6 ～ 12 時間で観察され、24 ～ 48 時間でピークに達します。
Q6: トランスフェクション効率が低い場合はどうすればいいですか?
A: 細胞が健全であり、適切な密度であることを確認します。
- mRNAの品質を確認してください： A260/A280が約2.0、RNAが無傷（分解なし）、5'キャップと3'ポリAテールの両方が存在する。適切な範囲内でmRNAの量を増やしてください。
- mRNA/試薬比率を最適化します。最適なパフォーマンスを得るには、mRNA/試薬比率を 1:3 ～ 1:5 の間で調整します。
- 複合体のインキュベーション時間を制御します。凝集を避けるために、複合体を 5 ～ 10 分間インキュベートします。
- 検出時間を最適化します。発現のピークは細胞の種類によって異なり、通常は 6 ～ 24 時間以内ですが、最大 48 時間の延長検出が必要になる場合もあります。
関連製品
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応用 |
名前 |
カタログ番号 |
サイズ |
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DNA、siRNA、miRNA、mRNA、ASOなどに対応します。 一次細胞における実証済みの成功。 |
40801 |
100μL/1.5mL |
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