1.実験材料
- HEK293 細胞:トランスフェクション時に細胞密度が 30%～50% に達する必要があります。
- siRNA:標的特異的siRNAまたはコントロールsiRNA（濃度 ≥ 10 μM）
- Hieff Trans TMブースター DNA&RNA トランスフェクション試薬 (カタログ番号 40801)
- 培養培地：完全増殖培地（血清および抗生物質を含む）
- 無血清培地（例：Opti-MEM® I 低血清培地）
[注記]：複合体を調製するために、siRNA とトランスフェクション試薬を希釈するために無血清培地が使用されます。
その他の材料: 滅菌遠心管、マイクロピペットおよび滅菌ピペットチップ、 CO₂インキュベーター、遠心分離機。
2.実験手順
1)トランスフェクション前日の準備
- トランスフェクション当日に 30%～50% のコンフルエンスに達する密度でHEK293 細胞を24ウェル プレートに播種します。
- 1 ウェルあたり0.5 ～ 1 mL の完全 DMEM (10% FBS を含む)を使用します。
- 37℃、5% CO₂で一晩インキュベートします。
[注記]：24ウェルプレートの場合、1ウェルあたり0.5～1 mLの細胞懸濁液を播種します。プレートを軽く揺すり、細胞を均一に分散させます。
2)siRNA-試薬複合体を調製する（ 6ウェルプレートのウェルあたり）
- si RNAを希釈します。50 nM の最終濃度の siRNA を50 μL の Opti-MEM で希釈します。
[注]：siRNAストックは通常10～20μMで調製されます。
- トランスフェクション試薬の希釈:別のチューブで、 1.5～ 2 μL のトランスフェクション試薬を 50 μL の Opti-MEM で希釈します。
- si RNA-トランスフェクション試薬複合体の形成: 2 つの溶液を合わせ、軽く混ぜ、室温で 10 ～ 15 分間インキュベートします。
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プレートフォーマット |
ウェルあたりの最終siRNA |
トランスフェクション試薬容量 |
複合体総量（Opti-MEMまたは無血清培地） |
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6ウェルプレート |
50～100 nM |
4～6μL |
200μL |
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24ウェルプレート |
10～50 nM |
1.5～2μL |
50μL |
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96ウェルプレート |
10～30 nM |
0.3～0.5μL |
20μL |
3)細胞トランスフェクション：細胞に添加
- ウェルから古い培養培地を取り除き、 0.5～ 1 mLの新鮮な完全DMEM （（血清含有、抗生物質不含））と交換します。
- 100 μL のsi RNA-試薬複合体をウェルに滴下します。
- プレートを軽く揺すりながら均等に広げます。
4)トランスフェクション後の取り扱い
- 細胞を37℃、5% CO₂でインキュベートします。
- 標的遺伝子と細胞の種類に応じて、トランスフェクション後 24 ～ 72 時間で遺伝子ノックダウンを分析します。
- 細胞毒性が観察されない限り、培地の交換は必要ありません。
[注]:時点はターゲットによって異なります。通常、qPCR は24 ～ 48 時間で、タンパク質ノックダウンはトランスフェクション後48 ～ 72 時間で行われます。
3.実験結果
1.幅広い細胞種への効率的なsiRNA送達
図1 ： Booster DNA&RNAトランスフェクション試薬とTブランドL*3000を用いた異なる細胞へのsiRNAトランスフェクション。この結果は、Boosterの優れたsiRNAトランスフェクション効率を示しています。
4.よくある質問（FAQ）と解決策
Q1: siRNA トランスフェクションに最適なコンフルエンスはどれくらいですか?
A: 効率的な取り込みを確保し、細胞の生存率を維持するために、トランスフェクション時に細胞は 30%～50% の集密度になっている必要があります。
Q2: トランスフェクション中に血清を含む培地を使用できますか?
A: Hieff Trans™ siRNA試薬を含む、ほとんどのポリマーベースのトランスフェクション試薬は血清と互換性があります。ただし、複合体形成中は最適な複合体形成を確保するために、無血清培地（例：Opti-MEM）を使用してください。
Q3: siRNA ストックの濃度はどのくらいにすべきですか?
A: siRNAストックの濃度は通常10～20 μMです。トランスフェクション反応において最終濃度が10～50 nMになるように適切に希釈してください。
Q4: 1 ウェルあたりどのくらいの量の siRNA を使用すればよいですか?
A: 24ウェルプレートの場合、最終siRNA濃度はウェルあたり10～50 nMが推奨されます。他のプレートフォーマットの場合は、適宜量を調整してください。
Q5: トランスフェクション後、いつ遺伝子ノックダウンを検出できますか?
A: mRNA ノックダウンは通常、トランスフェクション後 24 ～ 48 時間で検出されます。タンパク質ノックダウンは 48 ～ 72 時間の間に観察されることが多いです。
Q6: トランスフェクション効率が低い場合はどうすればいいですか?
答え:
- 細胞が健康であり、推奨される合流度（30％～50％）にあることを確認します。
- siRNA の完全性と配列特異性を検証し、劣化した siRNA を避けてください。
- siRNA と試薬の比率を推奨範囲内で最適化します（例：24 ウェル形式では、1 ウェルあたり 10～50 nM siRNA と 1.5～2 μL の試薬）。
- siRNA-試薬複合体のインキュベーション時間を制御します。安定した複合体を形成するために、室温で 10 ～ 15 分間インキュベートします。
- ノックダウンの速度は細胞の種類や遺伝子ターゲットによって異なるため、検出時間を最適化します。
注意: 細胞毒性を最小限に抑えるため、トランスフェクション後は新鮮な完全培地を使用し、トランスフェクション期間中は抗生物質の使用を避けてください。
5.関連製品
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応用 |
名前 |
カタログ番号 |
サイズ |
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DNA、siRNA、miRNA、mRNA、ASOなどに対応します。 一次細胞における実証済みの成功。 |
40801 |
100μL/1.5mL |
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