Polybrene (hexadimethrinbromid), også kendt som Polybrene, er en kationisk polymer, der almindeligvis anvendes i DNA-transfektionseksperimenter med pattedyrceller for at forbedre transfektionseffektiviteten af ​​liposomer. Det er almindeligt anvendt i retrovirus-medieret gentransfektion og lentivirus-medieret gentransfektion. Virkningsmekanismen kan involvere neutralisering af sialinsyren på celleoverfladen, hvilket letter adsorption ved at overvinde elektrostatisk frastødning med viruspartikler. Polybrene er også anerkendt som et antikoagulant (heparinantagonist) og bruges ofte til produktion af ikke-specifikt aggregerede røde blodlegemer. Derudover har lave doser af Polybrene i proteinsekventering vist sig at forbedre nedbrydningen af ​​peptider væsentligt i automatiseret sekventeringsanalyse. Tilføjelsen af ​​polybren til PVDF-membraner kan også øge membranaffiniteten.

Specifikation

Produktet leveres i opløsningsform, og pulveret rekonstitueres i 0,9 % NaCl til en 10 mg/ml opløsning, som derefter steriliseres med et 0,22 μm filter. Det fortyndes typisk i et forhold på 1:1000-1:2000 til brug, med specifikke fortyndingsforhold afhængigt af celletypen, som beskrevet i relevant litteratur.

Forsendelse og opbevaring

Transport og opbevaring anbefales ved -20 ºC, med en holdbarhed på 2 år. Det tilrådes at alikvotere og opbevare for at undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.

Forholdsregler:

1. Bær laboratorietøj og engangshandsker for sikkerhed og sundhed.

2. Dette produkt er kun til forskningsformål.

Operationelle trin

(til reference kan specifikke koncentrationer variere, se relevant litteratur):

Bemærk: Polybrene kan udvise betydelig toksicitet over for visse celler (såsom terminalt differentierede neuroner, DC-celler), og en toksicitetstest anbefales til indledende brug.

Forsøg 1: Retroviral infektion

1. Fremstilling af rekombinant retrovirus-stamopløsning: Dyrkningsceller indeholdende et monolag af transfektionsretrovirus-pakningsceller i en 100 mm skål med 5 ml vækstmedium (5 % serum). Efter 24 timer fjernes dyrkningsmediet og filtreres gennem et 0,45 μm filter.

2. Dyrkning af celler til infektion: I en 100 mm skål tilsættes 10 ml komplet vækstmedium med en celletæthed på 5×10⁵ pr ret.

3. Virusinfektion: Efter 24 timers cellekultur fjernes det komplette dyrkningsmedium. Inficer celler med 2 mL virussupernatant indeholdende Polybrene (slutkoncentration: 5-10 μg/mL) ved 37°C i 3-6 timer.

4. Saml viruspartikler: Tilsæt 8 ml komplet vækstmedium. Efter 2-3 dages dyrkning, opsaml dyrkningsmediet for at opnå viruspartikler.

Eksperiment 2: Transfektion

1. Dyrk celler i komplet vækstmedium med en celletæthed på ca. 50 %.

2. Efter 18-24 timers cellekultur forberedes en DNA-vækstmedium-polybrenblanding. Tilsæt komplet vækstmedium (2 mL til en 60 mm skål, 3 mL til en 100 mm skål) og forvarm til 37°C. Bland forsigtigt 10 ng~10 µg plasmid. Tilføj Polybrene til en slutkoncentration på 5-10 μg/ml. Bland forsigtigt. Hver komponent skal tilføjes i den angivne rækkefølge.

3. Fjern dyrkningsmediet og tilsæt DNA-vækstmediet-Polybrene-opløsningen til cellerne ved 37°C i 6-20 timer. Bland forsigtigt hver 1,5 time inden for de første 6 timers cellekultur.

4. Fjern DNA-vækstmediet-polybrenopløsningen. Dæk cellerne med DMSO-chokopløsning (15 % DMSO i 1× HBSS).Ryst forsigtigt kulturskålen i 10 sekunder, hver gang opløsningen tilsættes for at sikre ensartet fordeling. Inkuber cellerne ved 37°C i 4 minutter.

5. Fjern straks DMSO-chokopløsningen og vask forsigtigt cellerne to gange med komplet vækstmedium. For en 60 mm skål, vask med 5 mL dyrkningsmedium hver gang, og for en 100 mm skål, vask med 10 mL dyrkningsmedium hver gang.

6. Tilføj komplet vækstmedium til cellerne.

7. Proteinekspression: Efter 24-72 timers dyrkning indsamles celler til proteinekspressionsanalyse efter behov.

Cellevalg: Efter 24-72 timers dyrkning, baseret på cellestatus, skift til frisk selektionsmedium og fortsæt med celleselektion.