รูปที่ 1: กระบวนการถอดรหัส RNA ในหลอดทดลอง

ข้อดีของผลิตภัณฑ์

ผลผลิตสูง: สามารถผลิตได้มากถึง 200 μg ในเวลา 2 ชั่วโมงโดยผ่านปฏิกิริยาการถอดรหัส

ความคล่องตัวที่ดีขึ้น: เหมาะสำหรับการถอดรหัส RNA ขนาด 20nt-10000nt

ประสิทธิภาพที่ยอดเยี่ยม: ลดผลพลอยได้จากการถอดรหัสระหว่างกระบวนการ IVT ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

แอปพลิเคชั่นหลากหลาย: สามารถใช้สำหรับการสังเคราะห์ RNA ทั่วไป ที่มีการติดฉลาก และการดัดแปลง

คุณสมบัติของผลิตภัณฑ์

รูปที่ 2: ผลผลิตของทรานสคริปต์ที่มีความยาวต่างกัน

รูปที่ 3: คุณภาพของทรานสคริปต์ที่มีความยาวต่างกัน

รูปที่ 4: การแสดงออกของ ถอดความ เอ็มอาร์เอ็นเอ ใน เฮก-293 เซลล์

หมายเหตุ: mRNA ได้รับการปิดฝาด้วย Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen#10614/10615).

วิธีการทดลอง

สารละลายน้ำแข็ง

ปั่นส่วนผสม T7 RNA Polymerase สักครู่แล้ววาง มัน บนน้ำแข็ง ละลายบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10× และไรโบนิวคลีโอไทด์ส (ATP, CTP, GTP, UTP) ผสมให้เข้ากันแล้วปั่นไปที่ก้นหลอด วางบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10x ไว้ที่อุณหภูมิห้อง และวางไรโบนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดลงบนน้ำแข็ง

ข.ปฏิกิริยาการถอดรหัสประกอบที่อุณหภูมิห้อง

เตรียมระบบปฏิกิริยาตามระบบต่อไปนี้:

ส่วนประกอบ	ปริมาตร (µL)	ความเข้มข้นขั้นสุดท้าย
RNase ฟรี H2โอ้	สูงถึง 20	-
บัฟเฟอร์การถอดรหัส 10×	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM แต่ละตัว)	2 อัน	10 มิลลิโมลาร์แต่ละอัน
แม่แบบดีเอ็นเอ	1 ไมโครกรัม	-
ส่วนผสมโพลีเมอเรส RNA T7	2	-

หมายเหตุ:

1. ปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นที่อุณหภูมิห้อง เนื่องจากบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10× มีสเปอร์มิดีน ความเข้มข้นสูงของสเปอร์มิดีนอาจทำให้เกิดการตกตะกอนของเทมเพลตดีเอ็นเอที่อุณหภูมิต่ำ
   สำหรับการถอดรหัสแบบสั้น (<100 nt) สามารถใช้เทมเพลต 2 µg ได้ โดยระยะเวลาการถอดรหัสขยายเป็น 4-8 ชั่วโมง
   3. สำหรับการถอดรหัสที่ยาว (>1000 nt) แนะนำให้ใช้พลาสมิดเชิงเส้นเป็นแม่แบบสำหรับการถอดรหัส
   4. ทำปฏิกิริยาในเครื่อง PCR โดยเปิดฝาขณะร้อนเพื่อป้องกันการระเหย
   5. ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาอาจมีตะกอนสีขาว ตะกอนดังกล่าวคือแมกนีเซียมไพโรฟอสเฟตที่ผลิตขึ้นโดย ไอออนไพโรฟอสเฟตและแมกนีเซียมอิสระในสารละลายปฏิกิริยาซึ่งไม่ส่งผลต่อการทดลองในขั้นต่อไป หากคุณต้องการเอาไอออนเหล่านี้ออก คุณสามารถเติม EDTA ลงไปได้ หากการเติม EDTA ส่งผลต่อการทดลองในขั้นต่อไป คุณสามารถนำของเหลวส่วนบนกลับคืนมาได้ด้วยการปั่นเหวี่ยง
   6. เก็บสารเคมีและภาชนะบรรจุโดยไม่ให้มีการปนเปื้อนของ RNase

C.ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง

ผสมส่วนประกอบของสารละลายเข้าด้วยกัน ปั่นเหวี่ยงไปที่ก้นหลอดสักครู่ แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หากความยาวของทรานสคริปต์น้อยกว่า 100 nt ให้เพิ่มเวลาปฏิกิริยาเป็น 4-8 ชั่วโมง

การรักษาด้วย D.DNase I (ทางเลือก)

เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์แล้ว ให้เติม DNase I (ปราศจาก RNase) 2 μL ลงในแต่ละหลอด แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 15 นาทีเพื่อกำจัด DNA แม่แบบ

คำถามที่พบบ่อย

1. ผลผลิตการถอดเสียงต่ำ

คุณภาพของเทมเพลตมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับผลผลิต ผลผลิตของกลุ่มทดลองต่ำกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ:

• เทมเพลตการทดลองมีส่วนประกอบที่เป็นสารยับยั้ง
• เทมเพลตอาจมีบางอย่างผิดพลาด

ข้อเสนอแนะ: ① ทำการฟอกเทมเพลตอีกครั้ง ② กำหนดปริมาณเทมเพลตและความสมบูรณ์ของเทมเพลต ③ ขยายเวลาปฏิกิริยา ④ เพิ่มปริมาณอินพุตเทมเพลต ⑤ ใช้โปรโมเตอร์อื่นและ RNA โพลิเมอเรสอื่นๆ

2. ผลผลิตต่ำของบันทึกย่อสั้น

เทมเพลตขนาดสั้นสามารถยับยั้งปฏิกิริยาได้ เมื่อผลผลิตการถอดรหัสน้อยกว่า 100 nt หากคุณต้องการเพิ่มผลผลิต ให้ขยายเวลาปฏิกิริยาเป็น 4-8 ชั่วโมงหรือเพิ่มปริมาณเทมเพลตเป็น 2 μg

3. ความยาวของการถอดรหัส RNA คือ ใหญ่กว่า มากกว่าที่คาดหวัง

หากผลอิเล็กโตรโฟเรซิสแสดงให้เห็นว่าแถบผลิตภัณฑ์มีขนาดใหญ่กว่าขนาดที่คาดไว้ สาเหตุที่เป็นไปได้อาจเป็นดังนี้: ① เทมเพลตพลาสมิดอาจไม่เป็นเชิงเส้นอย่างสมบูรณ์; ② ปลาย 3' ของสายเซนส์มีโครงสร้างที่เด่นชัด; ③ RNA มีโครงสร้างรองที่ยังไม่ถูกเปลี่ยนแปลงอย่างสมบูรณ์

ข้อเสนอแนะ: ① ตรวจสอบว่าเทมเพลตเป็นเส้นตรงอย่างสมบูรณ์หรือไม่ และหากจำเป็น ให้ดำเนินการเส้นตรงเพิ่มเติม ② เลือกเอนไซม์จำกัดที่เหมาะสมเพื่อหลีกเลี่ยงส่วนยื่น 3' หรือใช้ Klenow Fragment/T4 DNA โพลิเมอเรสเพื่อทำการถอดรหัสให้เสร็จสิ้นก่อนดำเนินการต่อ ③ ใช้เจลที่ทำให้เสียสภาพเพื่อตรวจจับผลิตภัณฑ์ RNA

4. ความยาวของการถอดรหัส RNA คือ เล็กกว่า มากกว่าที่คาดหวัง

หากอิเล็กโตรโฟเรซิสแสดงให้เห็นว่าแถบผลิตภัณฑ์มีขนาดเล็กกว่าขนาดที่คาดไว้ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ คือ: ①เทมเพลตมีลำดับการสิ้นสุดคล้ายกับตัวสิ้นสุดของ RNA โพลิเมอเรส T7; ②เนื้อหา GC ของ เทมเพลตสูงเกินไป

ข้อเสนอแนะ: ①ลดอุณหภูมิปฏิกิริยา (เช่น 30°C) บางครั้งการลดอุณหภูมิอาจช่วยเพิ่มความยาวของการถอดรหัสได้ แต่ก็อาจ ลดผลผลิต ลองวิธีอื่น RNA โพลิเมอเรสสำหรับการถอดรหัส ②หากเนื้อหา GC ของเทมเพลตสูง ให้ทำปฏิกิริยาที่ 42℃ หรือเติม SSB เพื่อเพิ่มผลผลิตและความยาวในการถอดรหัส

5. การหางทางไฟฟ้าของผลิตภัณฑ์การถอดรหัส

การเกิดหางในระหว่างการอิเล็กโทรโฟเรซิสอาจเกิดจาก: ① การปนเปื้อนของ RNase ในระหว่างการปฏิบัติการทดลอง ②เทมเพลต DNA ถูกปนเปื้อนด้วย RNases

คำแนะนำ: ①ใช้ปลายปิเปตและหลอด EP ที่ปราศจาก RNase สวมถุงมือและหน้ากากลาเท็กซ์แบบใช้แล้วทิ้ง และเตรียมสารเคมีทั้งหมดด้วย H ที่ปราศจาก RNase₂O. ②ทำให้เทมเพลต DNA บริสุทธิ์อีกครั้ง

ข้อมูลการสั่งซื้อ

ชื่อสินค้า	หมายเลขแคตตาล็อก	สข้อมูลจำเพาะ
ชุดสังเคราะห์ RNA ประสิทธิภาพสูง T7	10623ES	50/100/500 ที
โพลิเมอร์ RNA ของ T7 เกรด GMP (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
ไพโรฟอสฟาเตส เกรดอนินทรีย์ GMP (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
สารยับยั้ง RNase ในหนู เกรด GMP (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
เอนไซม์ปิดฝาวัคซีน mRNA เกรด GMP	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase เกรด GMP	10612ES	10KU/50KU/250KU
ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (DNase I) เกรด GMP	10611ES	500/2000/10000 ยู
ชุดมาสเตอร์แยก mRNA Hieff NGS®	12603ES	24/96ต