1. Baixo rendimento de transcrição

A qualidade do template está intimamente relacionada ao rendimento. Se o rendimento do grupo experimental for significativamente menor que o do grupo de controle, as possíveis razões são:

① o modelo experimental contém componentes inibitórios;

② O modelo tem algo errado.

Sugestões:

① Repurifique o modelo;

② Determinar a quantificação do modelo e sua integridade;

③ Aumente o tempo de reação;

④ Aumentar a quantidade de entrada do modelo;

⑤ Experimente outros promotores e RNA polimerases.

2. Baixo rendimento de transcrições curtas

Um pequeno fragmento de iniciação de transcrição inibirá a reação. Quando o produto de transcrição for menor que 100 nt, estender o tempo de reação para 4-8 hs ou aumentar a quantidade de molde para 2 μg aumentará o rendimento de RNA.

3. O comprimento da transcrição do RNA é maior do que o esperado

Se a eletroforese mostrar que a banda do produto é maior que o tamanho esperado, as possíveis razões:

①O modelo do plasmídeo pode não ser completamente linearizado;

②A extremidade 3' da fita sentido tem uma estrutura proeminente;

③O RNA tem uma estrutura secundária que não é completamente desnaturada.

Sugestões:

①Verifique se o modelo está completamente linearizado e, se necessário, execute linearização adicional;

②Selecione uma enzima de restrição adequada para evitar saliências 3' ou use o Fragmento Klenow/DNA polimerase T4 para completar a transcrição antes de prosseguir;

③Use gel desnaturado para detectar produtos de RNA.

4. O comprimento da transcrição do RNA é menor do que o esperado

Se a eletroforese mostrar que a banda do produto é menor que o tamanho esperado, as possíveis razões:

①O modelo contém uma sequência de terminação semelhante à RNA polimerase T7;

②O conteúdo GC no modelo é alto.

Sugestões:

①Abaixe a temperatura da reação (por exemplo, 30°C). Às vezes, abaixar a temperatura pode aumentar o comprimento da transcrição, mas reduzirá o rendimento. Ou tente diferentes RNA polimerases para transcrição;

②Se o conteúdo do GC do modelo for alto, use 42℃ para transcrever ou adicionar SSB para aumentar o rendimento e o comprimento da transcrição.

5. Cauda de eletroforese de produtos de transcrição

Há um fenômeno de cauda durante a eletroforese.

Possíveis razões:

①Contaminado por RNase durante operação experimental;

②Modelo de DNA contaminado por RNase.

Sugestões:

①Use pontas de pipeta e tubos EP livres de RNase, use luvas e máscaras de látex descartáveis ​​e todos os reagentes são preparados com H2O livre de RNase.

②Repurifique o DNA modelo.

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) aumenta a patogenicidade fúngica ao modular a expressão do gene BmPEX16 em seu hospedeiro, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Quantificação ultrassensível de miR-195-5p circulante com cascata de amplificação de deslocamento de fita tripla. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)