Introdução para organoides
Organoides são culturas celulares tridimensionais nas quais células-tronco são incorporadas em um gel de matriz. Sob a influência de inibidores/ativadores químicos de pequenas moléculas, citocinas, e aditivos médios, essas culturas se desenvolvem em estruturas de tecidos semelhantes a órgãos.
Caracterização de organoides
Organoides ter o habilidade para auto-renovar, manter o fisiológico estrutura e função do tecido de origem, e são conhecidos como "micro-órgãos em uma placa de Petri". Usando a auto-renovação, habilidades de diferenciação e auto-organização das células-tronco, Os organoides podem ser criopreservados para uso como biobancos e expandido indefinidamente. Os organoides apresentam alta complexidade e se assemelham mais ao estado in vivo em comparação às culturas celulares 2D tradicionais.
![Figure 1. Organoid culture of human colon adenocarcinoma cells [1]](https://cdn.shopify.com/s/files/1/0803/9419/1166/files/1_5935b867-79e5-4a23-859d-b65fcd8e4c44_1024x1024.png?v=1740728801)
Figura 1. Organoide cultura de humano cólon adenocarcinoma células [1]
Aplicativo de organoides
Organoides permitem simulação superior do ambiente in vivo, preenchendo a lacuna entre modelos animais e estudos celulares. Eles servem como ferramentas poderosas para pesquisa de tumores, triagem de drogas, medicina regenerativa, e outros campos, com aplicações que vão desde a indução funcional de tecidos até estudos clínicos translacionais e têm sido amplamente utilizados em uma variedade de aspectos da pesquisa, como a indução funcional de tecidos, modelagem de doenças, triagem de drogas, testes anti-inflamatórios, estudos clínicos finais e outras pesquisas, e têm sido usados em pesquisas básicas e aplicações translacionais.Tem grandes perspectivas de aplicação em pesquisa básica e aplicações translacionais.
Com o desenvolvimento contínuo de sistemas de cultura organoide e técnicas experimentais, culturas organoides têm sido usadas para uma variedade de tecidos e órgãos, incluindo intestinos (intestino delgado/cólon), estômago, fígado, coração, pulmões, próstata, pâncreas, rins, glândulas mamárias, cérebro, retina, e ouvido interno.
Organoides derivados de células-tronco tumorais também começaram a mostrar grande potencial para ajudar a entender o mecanismo de desenvolvimento do tumor, triagem de sensibilidade a medicamentos, e promovendo medicina de precisão e diagnóstico personalizado. Vários artigos da Cell and Science mostraram que organoides tumorais têm alta sensibilidade e especificidade na previsão da eficácia de medicamentos anticâncer. Recentemente, Foi demonstrado que organoides tumorais são úteis na previsão das respostas dos pacientes aos medicamentos contra o câncer e ajudam a desenvolver regimes medicamentosos personalizados.
1.Estudo dos mecanismos de desenvolvimento: a capacidade de diferenciação possuída pelos organoides pode ser usada no estudo dos processos de desenvolvimento embrionário e seus mecanismos.
Os organoides regulam processos induzidos por vias de sinalização como Wnt e BMP, que pode ser usado para estudar o desenvolvimento de órgãos como o cérebro, pâncreas e estômago.[2][3][4]
2.Modelagem de danos causados por doenças: tecidos ou órgãos específicos induzidos por organoides que podem ser usados para pesquisas em modelos específicos de doenças.
A equipe de Bing Zhao e Xinhua Lin aplicou um modelo de infecção de órgão semelhante ao humano para estudar o mecanismo molecular da infecção por SARS-CoV-2 (o novo coronavírus) e danos ao fígado, que fornece uma ferramenta importante para o estudo da patogênese do neocoronavírus e subsequente desenvolvimento de medicamentos.[5]
O grupo de pesquisa de Deng Hongkui na Escola de Ciências Biológicas da Universidade de Pequim construiu um novo organoide de intestino delgado-hiper organoide com características de regeneração de lesões in vitro usando pequenas moléculas e citocinas para estimulação. Este organoide tem as características de ser capaz de amplificar e manter o genoma em transmigração de longo prazo, promover a reparação de danos nos tecidos do cólon, e aliviar sintomas patológicos em modelos animais de colite aguda.[6]
3.Medicina regenerativa: organoides derivados de células-tronco, que são capazes de reparar ou substituir tecidos danificados ou doentes para restaurar a função normal do tecido, têm uma ampla gama de aplicações em terapia celular, incluindo para outras doenças neurodegenerativas, diabetes, doenças cardiovasculares, retinopatia e lesões na coluna.
Como uma nova modalidade terapêutica no campo da medicina regenerativa, o DA01 utiliza as pequenas moléculas SB-431542 (Cat#53004ES), LDN193189 (Cat#53012ES), CHIR-99021
(Cat#53003ES), e Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES), e proteína Sonic Hedgehog (Shh) (Cat#92566ES, Cat#92589ES), para estimular a diferenciação de células-tronco pluripotentes em neurônios dopaminérgicos e transplante em áreas lesadas do cérebro de pacientes com doença de Parkinson avançada, para fornecer novas direções e ideias para o tratamento da doença.[7]
4.Testes de toxicidade e eficácia de medicamentos: uso de organoides para verificar a toxicidade farmacocinética de novos medicamentos em órgãos ou tecidos específicos, fornecendo suporte de dados para o desenvolvimento de novos medicamentos.
A nefrotoxicidade da cisplatina (cisplatina) foi verificada usando o organoide renal de Hyman.[8]
5.Triagem de drogas: organoides derivados de células-tronco podem ser usados para testes in vitro de respostas a medicamentos, fornecer suporte teórico para triagem de drogas
Órgãos colônicos podem ser usados para estudar regimes de dosagem em pacientes com mutações CFTR, e órgãos tumorais podem ser usados para avaliar a dosagem individualizada em pacientes.[9]
A evolução dos organoides
Fontes de organoides
Os organoides normais são derivados principalmente de células-tronco, que incluem células-tronco pluripotentes (PSCs) e células-tronco adultas (ASCs), das quais as células-tronco pluripotentes incluem células-tronco embrionárias (CTEs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Comparado com células-tronco pluripotentes, células-tronco adultas têm a vantagem de modelagem fácil e rápida, mas a desvantagem é que as estruturas organoides construídas são relativamente simples. As estruturas organoides construídas por células-tronco pluripotentes são mais complexas.
Cultura organoide
| Organoie Tipo | Obrigatório Sshopping center Molécula | Obrigatório Gfileira Fatores | Mídia e Aditivos |
| Intestino delgado | Y-27632, SB-202190, UM 83-01, Gastrina, Nicotinamida | FEG, Cabeça, R-Espondina 1, Wnt-3a | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina, N-2 |
| Gástrico | Y-27632, SB-202190, UM 83-01, Gastrina EU, Nicotinamida | FGF-10, FEG, Cabeça, R-Espondina 1, O que-3a | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina- estreptomicina |
| eudoença de iver | Y-27632, UM 83-01, DAPT, Forscolina, Gastrina, Nicotinamida, Prostaglandina E2 | BMP-4, FEG, FGF-básico, FGF-10, FGH, Cabeça, O que-3a | N-2, HEPES, eu-solução de alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| rim | CHIR-99021、Ácido Retinóico | BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF- básico 、FGF-9 | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| eujovens | CHIR-99021、SB-431542 | Ativina A、FGF- básico、FGF-4、Cabeça | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Pancreas | Gastrina I、Um 83-01、Nicotinamida | FGF-10、 FEG、Cabeça、R-Espondina 1、Wnt-3a | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Prostate | Y-27632、SB-202190、Um 83-01、Nicotinamida、Prostaglandina E2、Testosterona | FEG、Ativina A、FGF- básico、FGF-10、Cabeça、R-Spond em 1、Wnt-10b | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Mglândula amária | Y-27632 | Aqui gulin β-1、R-Espondina 1、R-Espondina 2、Cabeça、FEG、 FGF- básico、FGF-10、Wnt-3a、Prolactina | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Retina | CHIR-99021、Y-27632 | Silêncio、Wnt-3a | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| EUouvido interno | SB-431542、Um 83-01 | BMP-4、 FGF- básico | HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Bchuva | Y-27632、MK-2206、GDC-0068、Dorsomorfina | FGF- básico、Cabeça、Coroa dinamarquesa-1、 FEG、BDNF、GDNF | B-27, HEPES, Solução de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
Sresumo de spequenas moléculas comumente usadas na cultura de organoides: super útil, não esqueça de marcar como favorito!
❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): É um potente inibidor de Rock, que inibe p160ROCK (Ki=140 nM) e ROCK-II (IC50=800 nM) competitivamente com ATP, e também inibe PRK2 (IC50= 600 nM), e geralmente é adicionado na primeira vez da cultura na placa de sementes, mas não na cultura subsequente.Y-27632 (10 µM) pode inibir a apoptose de células-tronco, melhorar a eficiência da clonagem e prolongar a progênie celular tratando células-tronco embrionárias humanas com Y-27632 (10 µM) por 1 h.
A concentração de trabalho recomendada é 10 μM
❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Um potente inibidor da cinase p38 MAPK que tem como alvo p38α/β. SB202190 induz a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em cardiomiócitos, promove a autorrenovação das células-tronco neurais, e pode ser usado em culturas de organoides gastrointestinais e mamários.
Concentração de dissolução recomendada: 10 mg dissolvidos em 10 mM pela adição de 3,018 mL de solução de DMSO e armazenados a -20°C em porções.
A concentração de trabalho recomendada é 10 μM
❸ CHIR-99021 (Cat# 53003ES): Um derivado de aminopirimidina que atua como um inibidor de GSK-3 (GSK3α/β), que induz a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em direção ao endoderma, e é usado em culturas de organoides renais e da retina. CHIR-99021, em combinação com outros reagentes, estimula a reprogramação de células somáticas em células-tronco.
Concentração de dissolução recomendada: 5 mg dissolvidos em 3 mM pela adição de 3,58 mL de solução de DMSO e armazenados a -20°C em porções.
O rconcentração de trabalho recomendada: 3 μM
❹ A 83-01 (Cat#53002ES): é um inibidor da via Activina/NODAL/TGF-β que inibe a atividade da cinase ALK5/4/7 e é geralmente usado no fígado, próstata, e culturas de organoides mamários, e é frequentemente usado para inibir a diferenciação de iPSCs e para manter a autorrenovação de células in vitro. Concentração de dissolução recomendada: 5 mg adicionados a 5,93 mL de solução de DMSO para dissolver a 2 mM, -20 ℃ dividido e armazenado. (Nota especial: Este produto é instável em estado de solução, é recomendado usá-lo agora.)
O rconcentração de trabalho recomendada: 2 μM
❺ Gastrina I (Cat#53007ES): A gastrina é um hormônio peptídico gastrointestinal endógeno que estimula a secreção de ácido gástrico das células do revestimento gástrico. A gastrina se liga ao receptor de colecistocinina B (CCKBR), que aumenta o Ca2+ intracelular, promove a produção de fosfatidilinositol, e ativação da proteína quinase C. A gastrina também está envolvida na proliferação e diferenciação de células epiteliais gástricas e é usada no estudo de órgãos semelhantes aos gastrointestinais. A adição de gastrina é necessária para prolongar a sobrevivência de organoides intestinais e hepáticos em cultura.
Concentração de dissolução recomendada: 1 mg dissolvido em 0,2 mM pela adição de 2,38 mL de solução de amônia a 1% e armazenado a -20°C em porções.
O rconcentração de trabalho recomendada: 10 nM
❻ Nicotinamida Nicotinamida (Cat# 51402ES): Uma vitamina B3 envolvida em uma variedade de reações redox enzimáticas e é usada no trato gastrointestinal., fígado, e culturas de organoides mamários.
A nicotinamida é usada em conjunto com citocinas e outros produtos bioquímicos para exercer propriedades anti-inflamatórias e promover a diferenciação de MSCs em células produtoras de insulina, para inibir a atividade das sirtuínas, e promover a formação de organoides e prolongar a vida útil dos organoides.
Concentração de dissolução recomendada: 100 mg dissolvidos em 100 mM pela adição de 8,19 mL de H2O (ou DMSO) e armazenados a -20°C em porções.
O rconcentração de trabalho recomendada: 10 mM
❼ Tricoteceno de forskolina (Cat#51001ES): Ativa a adenilil ciclase e é comumente usado para aumentar os níveis de AMPc intracelular. A forskolina induz a diferenciação de muitos tipos de células e ativa PXR e FXR. Possui efeitos anticoagulantes e anti-hipertensivos plaquetários e, quando combinado com outras moléculas pequenas, pode induzir a reprogramação de fibroblastos para iPSCs. Esta substância deve ser adicionada a culturas de organoides do fígado. reprogramados em iPSCs. deve ser adicionado durante a cultura de órgãos semelhantes ao fígado. Concentração de trabalho recomendada: 1-10 μM
❽ Prostaglandina E2 (Cat#60810ES): A prostaglandina E2 (PGE2) regula muitos sistemas fisiológicos, media a proliferação e diferenciação celular ao se ligar a receptores específicos, é necessário adicionar a culturas de órgãos semelhantes ao fígado e à próstata, e tem sido implicado na preservação do músculo liso, inflamação, fertilidade, regulação do ciclo do sono e integridade da mucosa gástrica.
Concentração de dissolução recomendada: 1 mg adicionado a 0,28 mL de solução de DMSO dissolvida a 10 mM e armazenada a -20°C em porções.
Concentração de trabalho recomendada: 500 nM
❾ N-acetil-L-cisteína (Cat#50303ES): N-acetil-L-cisteína (NAC) é um precursor do antioxidante glutationa, que tem propriedades antioxidantes, e um inibidor de ROS que inibe a apoptose em células neuronais, e que deve ser adicionado na maioria das culturas organoides.
Concentração de dissolução recomendada: 2 g adicionados a 24,51 mL de H2O (ou DMSO) dissolvidos a 500 mM e armazenados a -20°C em porções.
Concentração de trabalho recomendada: 1 mM
Produto Recomendaçãonão
Compostos de pequenas moléculas (inibidores/ativadores)
| Nome do produto | Número de catálogo | Sespecificação |
| Retinóico ácido (retinóico ácido retinóico ácido) | 100 mg/500 mg/1 g | |
| UM 83-01 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| CHIR-99021 | 2 mg/5 mg/10 mg | |
| SB-431542 | 5 mg/10 mg/50 mg | |
| SB-202190 | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| Y-27632 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| Gastrina EU (humano) | 1 mg/5 mg | |
| MK-2206 2HCl | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| GDC-0068 (Ipatasertibe; RG7440; (GDC0068) | 53009ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| (Dorsomorfina (2HCl) | 53010ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| Y-27632 dicloridrato | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| Nicotinamida | 1 g/5 g | |
| DAPT (GSI-IX, LY-374973) | 5 mg/25 mg | |
| Forscolina Cabelo Garganta | 10 mg/50 mg/100 mg/1 g | |
| Prostaglandina (PG) E2 Prostaglandina E2 | 60810ES | 1 mg |
| Testosterona | 60803ES | 1 g/5 g |
| NAC (N-acetil-L-cisteína) | 50303ES | 2 g |
| RepSox | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| LDN193189 (DM-3189) | 53012ES | 5 mg/10 mg |
Mídia e suplementos
| Número de catálogo | Sespecificação | |
| HEPES Livre Ácido Célula Cultura Nota | 60110ES | 100 g/500 g |
| L-alanil-L-glutamina solução, 200 mM L-alanil-eu-glutamina, 200 mM | 60701ES | 20 mL/100 mL/500 mL |
| Penicilina-Estreptomicina (100×), Adequado para Célula Com ltura Penicilina-Estreptomicina (Dual Anticorpo) para C ele Cultura |
100 mL | |
| B-27 sem soro médio, 50 x | 60703ES | 10 mL |
| N-2 suplemento, sérum livre, 100X N-2 sérum livre aditivo, 100× | 60706ES | 5 mL |
Citocina
| Nome do produto | Número de catálogo | Sespecificação |
| Recombinante Humano Ativina UM | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| 10 μg/100 μg/500 micrograma | ||
| Recombinante Humano Coroa dinamarquesa-1 | 20 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano FEG | 100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano bFGF | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano FGF-4 | 5 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano FGF-9 | 91305ES | 5 μg/100 μg/500 micrograma |
| Recombinante Humano FGF-10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 micrograma |
| Recombinante Humano GDNF | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano Cabeça | 5 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano NRG1-beta1 | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano R-Espondina 1 | 92274ES | 100 µg/1 mg |
| Recombinante Humano Psiu | 5 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano BAFF | 5 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano sCD40 Ligante | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano BMP-4 | 10 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano FGH | 5 μg/100 μg/500 micrograma | |
| Recombinante Humano BDNF | 5 μg/20 μg/100 micrograma |
Mini-aula: Compostos de moléculas pequenas são compostos com peso molecular menor que 1000 Da (especialmente menor que 500 Da) e que possuem atividade biológica.Ao contrário das citocinas e proteínas, pequenas moléculas podem entrar na célula através da membrana celular e cumprir suas funções biológicas. Os compostos de pequenas moléculas têm uma ampla gama de alvos e têm sido amplamente utilizados em muitas pesquisas importantes campos em ciências da vida, como caule células, organoides, imunologia, neurobiologia, epigenética, apoptose, canais iônicos, oncologia e transdução de sinal.
Referências
[1] Sato T, Stange DE, et al. Expansão de longo prazo de organoides epiteliais de cólon humano, adenoma, adenocarcinoma e epitélio de Barrett. Gastroenterologia. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi:10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Set 2. PMID: 21889923.
[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Organoides cerebrais modelam desenvolvimento do cérebro humano e microcefalia. Natureza. 2013;501(7467):373-379. doi:10.1038/nature12517.
[3] Greggio C, et al. Nichos tridimensionais artificiais desconstroem o desenvolvimento do pâncreas in vitro. Desenvolvimento. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.
[4] McCracken KW, et al. Modelagem do desenvolvimento humano e da doença em organoides gástricos derivados de células-tronco pluripotentes. natureza. 2014.516(7531):400- 404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.
[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulação da infecção por SARS-CoV-2 e danos aos colangiócitos com organoides ductais do fígado humano. Protein Cell. 2020 Out;11(10 ):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.
[6] Qu M, Xiong L, et al. Estabelecimento de culturas organoides intestinais modelando a regeneração epitelial associada a lesões. Cell Res. 2021 Mar;31(3). 259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 Jan 8. PMID:
[7] 33420425; PMCID: PMC8027647.
[8] BlueRock Therapeutics anuncia primeiro paciente dosado com DA01 em estudo de fase 1 em pacientes com doença de Parkinson avançada. Comunicado à imprensa da BlueRock Therapeutics: 8 de junho de 2021.
[9] Takasato M, Er PX, et al.Organoides renais de células iPS humanas contêm múltiplas linhagens e modelam a nefrogênese humana. natureza. 2015.526(7574):564 -568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.
[10] Spence JR, Mayhew CN, et al. Diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes humanas em tecido intestinal in vitro. Natureza. 2011.470(7332):105- 109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.