Reduza o tempo com eficiência, verifique a qualidade com a atualização mais recente do processo de transcrição de mRNA do OnePot!

Nos últimos anos, o desenvolvimento e a aplicação da tecnologia de mRNA continuaram a atrair atenção. Os medicamentos de mRNA envolvem a inoculação de mRNA que codifica proteínas de antígeno no corpo humano. Ao utilizar o material genético dentro das células humanas, eles expressam e sintetizam proteínas de antígeno. Esse processo induz e ativa o sistema imunológico do corpo por meio de proteínas de antígeno, visando prevenir e tratar doenças. Os medicamentos de mRNA têm vantagens como segurança, eficiência e um ciclo curto. Eles podem induzir simultaneamente imunidade humoral e celular e têm sido aplicados em várias indicações, incluindo tumores, doenças infecciosas, doenças raras, doenças cardiovasculares e muito mais.

Todo o processo de desenvolvimento de medicamentos de mRNA pode ser dividido em várias etapas:

Determinação e design de sequência — transcrição in vitro de mRNA — preparação de encapsulamento

O convencional as etapas da transcrição in vitro (IVT) do mRNA incluem:

Extração e linearização de DNA plasmídico—Purificação de DNA plasmídeo—Transcrição in vitro (co-transcricional capping)—Purificação—solução estoque de mRNA

O um pote O processo de transcrição in vitro (IVT) do mRNA inclui:

Extração e linearização de DNA plasmídico—Transcrição in vitro (co-transcricional capping)—Purificação—solução estoque de mRNA

Atualmente, a maioria dos processos existentes envolve uma única etapa de purificação para DNA plasmídeo após clivagem enzimática antes da etapa IVT. A Yeasen Biotechlogy, com base em um centro de desenvolvimento de aplicação de mRNA maduro, desenvolveu o processo "Onepot mRNA Transcription". Neste processo, o DNA plasmídeo circular não é purificado após a clivagem enzimática; em vez disso, ele é usado diretamente para transcrição in vitro, resultando em uma solução estoque de mRNA de alta qualidade. Todo esse processo, ao mesmo tempo em que garante a qualidade do produto e do processo, encurta a duração do processo existente.

Vantagens do processo:

1. Otimização de processos, reduzindo etapas de IVT para uma operação mais simples.
2. Menores custos de material, eliminando a necessidade de purificação pós-clivagem e inspeção de qualidade.
3. Manutenção da qualidade e do rendimento do mRNA.

Dados:

1. Rendimentos e Integridade:

Usando o 1μg de plasmídeos linearizados de 2K, 4K e 9K, o processo onepot pode gerar 150-200μg de mRNA.

Comprimento	Rendimentos	Integridade
2K	200 micrograma	94,00%
4K	185 micrograma	92,20%
9K	150 mcg	87,50%

O teste de integridade foi realizado usando eletroforese capilar (CE) para avaliar a integridade de fragmentos com comprimentos de 2K, 4K e 9K. A integridade dos fragmentos de 2K e 4K foi >92%, e a integridade dos fragmentos de 9K foi >87%.

2. Detecção de eficiência de encapsulamento de mRNA

A LC-MS foi empregada para avaliar a eficiência de cobertura da sequência 2K, revelando uma eficiência de cobertura de 99,5%.

Imagem superior: Cromatograma HPLC UV

Imagem inferior: Espectro de peso molecular deconvoluído

3. Detecção de eficiência de poliadenilação de mRNA

LC-MS foi usado para detectar a eficiência de poliadenilação das amostras, mostrando resultados distribuídos normalmente.

Imagem superior: Cromatografia líquida TIC cromatograma

Imagem inferior: Espectro de peso molecular deconvoluído

4.Expressão de mRNA Ensaio

Transfecção de células 293T com produtos de mRNA sintetizados usando ambos os convencional processo (À esquerda, plasmídeos linearizados ccom purificação) e o processo one-pot (à direita, plasmídeos linearizados sem purificação) não mostrou diferença na expressão da proteína de fluorescência após 24 horas de cultura.

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