Sobre a T4 DNA Ligase
No entanto, a T4 DNA Ligase ainda enfrenta alguns desafios em aplicações práticas, incluindo baixa estabilidade, alta ligação adaptador-adaptador ou baixo rendimento da biblioteca de DNA. Esses problemas podem levar à redução da eficiência experimental, diminuição da qualidade dos dados, baixa repetibilidade dos resultados experimentais e baixa pureza do produto, afetando assim a eficácia geral dos experimentos de biologia molecular e a precisão dos dados de sequenciamento. Para resolver esses problemas, a Yeasen, com base no inovador ZymeEditor da sua subsidiária Molefuture™ A plataforma de evolução enzimática realizou a evolução enzimática na ligase T4 DNA.
Fig 1 Diagrama esquemático do princípio de reação da T4 DNA Ligase[1]
Triagem experimental iterativa úmida e seca para obtenção de T4 DNA Ligase de alto desempenho
A ligase T4 DNA, uma enzima ligase dependente de ATP, compreende um domínio de ligação de DNA helicoidal compacto (DBD), um domínio de nucleotidil-transferase (NTase) e um domínio de dobra OB. Com base na estrutura da proteína, Yeasen's equipe analisou os resíduos abrangendo distâncias de 5 a 20Å ao redor do substrato de DNA, seguido por triagem in silico e análise de estrutura-função usando ferramentas computacionais avançadas. Durante esse processo, a equipe observou um loop flexível situado distante do bolso ativo. Guiado por cálculos de energia, a equipe projetou truncamentos nesta região de loop, levantando a hipótese de que isso pode não impactar significativamente a função de ligação, mas pode afetar a estabilidade estrutural geral. Além disso, a equipe sequências de consenso alinhadas para projetar mutantes, acoplando essa análise com considerações estruturais e funcionais, conforme ilustrado na figura abaixo.
Fig 2 Estrutura da T4 DNA Ligase
Além do design racional, a evolução direcionada da ligase de DNA T4 foi conduzida com o método MTPS, rastreando a estabilidade, atividade e atividade residual. E uma biblioteca de mais de 104 mutantes foram selecionados. Após uma análise completa dos dados de mutação, candidatos promissores foram selecionados para purificação e testes rigorosos. Então, todos os vencedores obtidos por design racional e evolução direcionada foram submetidos a caracterização detalhada após purificação refinada, abrangendo avaliações de atividade, estabilidade, autoligação do adaptador, autoligação do fragmento de DNA e rendimento de DNA. Com base nos mutantes G1, a equipe conduziu embaralhamento de DNA e projeto combinado de mutação direcionada para obter mutantes excepcionais que atendem a diversos requisitos de aplicação.
Do mutante ao produto de mercado com múltiplas rodadas de validação de sequenciamento
O Editor ZymeTM A plataforma de evolução enzimática desenvolveu com sucesso um mutante de ligase de DNA T4 com alta estabilidade térmica, alto rendimento de biblioteca e baixa autoligação do adaptador por meio da tecnologia de evolução enzimática. A T4 DNA Ligase atualmente aprimorada foi lançada com sucesso: Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Este produto supera a tradicional T4 DNA Ligase de tipo selvagem em termos de eficiência de ligação e estabilidade térmica, e foi verificado por sequenciamento de alto rendimento, garantindo excelente qualidade.
Apresentação de dados
1.Maior estabilidade térmica
Os mutantes da T4 DNA Ligase de Yeasen foram submetidos a tratamento térmico a 42℃ por 0, 2 e 4 horas, e foram comparados com T4 DNA Ligases do Fornecedor Q, N, A e T.Posteriormente, uma biblioteca de DNA do genoma completo foi construída usando 1 µg de gDNA bovino fragmentado com o Kit de Construção de Biblioteca de DNA Yeasen (Cat#12927ES) para comparar a estabilidade térmica da T4 DNA Ligase.
Fig 3 Teste de estabilidade térmica a 42℃
Resultados:
Estabilidade térmica: Yeasen ≈ Fornecedor N ≈ Fornecedor A > Fornecedor T > Fornecedor Q.
2.Maior rendimento da biblioteca
O mutante T4 DNA Ligase de Yeasen foi testado quanto ao rendimento da biblioteca em níveis altos e baixos de entrada de DNA, em comparação com T4 DNA Ligases do Fornecedor Q, N, A e T. O Kit de Construção de Biblioteca de DNA de Yeasen (Cat#12927ES) foi usado, com 1 µg e 0,5 ng de gDNA bovino fragmentado sendo inseridos para construir bibliotecas de DNA.
Fig 4 Análise de rendimento da biblioteca de DNA
Resultados:
Rendimento da biblioteca (1 µg gDNA): Levedura > Fornecedor Q ≈ Fornecedor T ≈ Fornecedor A > Fornecedor N. Rendimento da biblioteca (0,5 µg gDNA): Levedura ≈ Fornecedor Q ≈ Fornecedor A ≈ Fornecedor T > Fornecedor N.
3.Autoligação do adaptador inferior
O mutante T4 DNA Ligase de Yeasen foi comparado com T4 DNA Ligases do Fornecedor Q, N, A e T para autoligação do adaptador. O Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) foi usado, com 0 ng e 0,5 ng de gDNA bovino fragmentado sendo inseridos para construir bibliotecas de DNA de genoma completo.
Fig 5 Dados de autoligação do adaptador com entrada de gDNA de 0 ng (esquerda) e 0,5 ng (direita)
Resultados:
1) Taxa de autoligação do adaptador (0 ng gDNA): Fornecedor N > Yeasen > Fornecedor T > Fornecedor A > Fornecedor Q.
2) Taxa de autoligação do adaptador (0,5 ng gDNA): Yeasen > Fornecedor T > Fornecedor Q ≈ Fornecedor N > Fornecedor A.
Contate-nos
Yeasen superou com sucesso as limitações das ligases de DNA T4 tradicionais, oferecendo um produto de ligase de DNA T4 que se destaca em estabilidade térmica, rendimento de biblioteca e autoligação do adaptador. Neste processo, a empresa acumulou uma rica biblioteca de mutantes, fornecendo aos pesquisadores uma variedade de opções para atender a diferentes necessidades experimentais. Se você estiver interessado em nossos produtos ou mutantes de ligase de DNA T4, sinta-se à vontade para entrar em contato conosco através dos seguintes métodos. E-mail: order1@yeasen.com (NÓS)
Telefone: +1 240-472-6069 (EUA)
Além disso, a Yeasen oferece uma gama de séries de produtos T4 DNA ligase. Clique no link do produto para perguntar sobre informações do produto
Série de produtos Yeasen T4 DNA Ligase
| posicionamento do produto | Nome do produto | Cat. Não. |
| Alta estabilidade térmica e baixa taxa de autoligação | Hieff® Ligase de DNA T4 versátil (600 U/μL) | 12996ES |
| Ligação rápida e eficiente, baixo resíduo, perfeitamente adequada para necessidades de detecção de patógenos. | Ligase rápida de DNA T4 (400 U/µL) | 10299ES |
| modelo universal | Ligase rápida de DNA T4 (400 U/µL) | 10301ES |
Referências
[1] Ligases Shuman S.DNA: Progresso e Perspectivas[E].Jornal de Química Biológica, 2009, 284(26):17365-17369.
