소개
아가로스 겔 전기영동은 아마도 실험실에서 처음 수행하는 실험 중 하나일 것입니다. 오늘은 이 필수적인 기술에 대해 자세히 알아보겠습니다. 기본 원리부터 실용적인 팁과 문제 해결 전략까지 자세히 살펴보겠습니다.
I. 원칙 섹션
1) 아가로스 겔 전기영동의 원리는 무엇 입니까 ?
아가로스 겔 전기영동은 아가로스를 지지 매트릭스로 사용하는 방법으로, DNA 단편 회수, 크기 분리, 재조합 DNA 또는 플라스미드 소화 검증에 널리 사용됩니다.
작동 원리: 아가로스는 다공성 네트워크 구조를 형성하여 DNA가 이동할 때 저항을 발생시킵니다. DNA 조각은 크기와 전하가 다르기 때문에 전기장 하에서 서로 다른 속도로 이동합니다. 즉, 음극에서 양극으로 이동하며, 이를 통해 크기에 따른 분리가 가능합니다.
II. 실무 섹션
1) 적절한 아가로스 농도를 선택하는 방법은 무엇입니까?
답변: 작업하는 핵산 조각의 크기에 따라 선택하세요. 준비 지침은 표준 농도표를 참조하세요.
2) 핵산 염색약은 어떻게 선택하나요?
답변: 시중에 판매되는 일반적인 핵산 염색제로는 EB , GoldView , GelRed/GelGreen 등이 있습니다 .
- EB(에티듐브로마이드): DNA 염기쌍 사이에 끼어들어 300nm와 360nm에서 최대 자외선 흡수를 나타내고 590nm에서 주황-적색 형광을 방출합니다. 높은 감도와 저렴한 가격이 장점이지만, 돌연변이를 유발하고 인체에 독성이 있습니다.
- GoldView: 주로 아크리딘 오렌지로 구성되어 있으며, DNA와 RNA를 모두 염색하고 다양한 형광 색상을 나타냅니다. 여기 피크는 492nm이고, 방출 피크는 530nm(DNA)와 640nm(RNA)입니다. 큰 단편에는 효과적이지만, 작은 단편(500bp 미만)에는 적합하지 않습니다. 자외선 하에서 형광이 빠르게 사라지므로 젤 회수에 적합하지 않습니다.
-
겔레드/겔그린: 세포막을 관통하지 않으므로 더 안전한 대안입니다.
- GelRed는 붉은 형광을 방출합니다(EB와 유사).
- GelGreen은 녹색 형광을 방출합니다(SYBR® Green 또는 SYBR® Safe와 유사).
- 두 제품 모두 UV와 호환되며, GelGreen은 청색광 투과 조명에도 적합합니다.
3) 성공적인 겔 전기영동을 위한 핵심 팁:
- 겔 플라스크를 너무 많이 채우지 마세요. 가열하는 동안 넘칠 수 있으므로 용량을 50% 이하로 유지하세요.
- 가열하는 동안 아가로스가 완전히 녹도록 합니다 . 증발을 줄이기 위해 밀봉 필름(밀폐용이 아닌)으로 덮습니다.
- 젤을 적절한 온도에 붓습니다. 거품이 생기지 않도록 너무 뜨겁지 않게 하세요.
- 얼룩 추가: 젤에 얼룩을 미리 섞어 놓거나(편리함) 얼룩 제거 후에 담가두는 방법을 사용할 수 있습니다.
III. 문제 해결 섹션
1) 밴드가 잘 분리되지 않았나요?
가능한 원인:
- 전기영동 시간이 너무 짧습니다. 더 길게 실행해보세요.
- 겔 농도가 올바르지 않습니다. 무게 측정이나 증발 오류를 확인하세요.
- 샘플의 염 농도가 높으면 이동성에 영향을 미칠 수 있습니다.
2) 전기영동 후 밴드가 보이지 않습니까?
두 가지 시나리오:
-
마커와 샘플 모두 밴드를 표시하지 않습니다.
- 염료가 첨가되지 않았거나 분해되지 않음
- 잘못된 전기영동 매개변수
-
마커는 밴드를 표시하지만 샘플은 표시하지 않습니다.
- PCR이 타겟 증폭에 실패했습니다. PCR 조건을 최적화하세요.
- 로딩 버퍼가 제대로 추가되지 않았습니다.
- 핵산 추출에 실패했거나 농도가 너무 낮습니다.
3) 웃는 얼굴로 밴드를 착용하는 것과 밴드를 문지르는 것?
겔, 염색, 샘플 또는 전기영동 조건의 문제로 인해 발생할 가능성이 있습니다.
- 젤 관련:
아가로스 용융이 불완전하거나 겔 경화 시간이 부족하면 기공 크기가 고르지 않고 이동도 고르지 않게 됩니다.
-
얼룩 관련:
- 염색 중 고온은 염료 구조를 손상시킬 수 있습니다. 젤이 40~50°C로 식었을 때 염색약을 첨가하세요.
- 얼룩의 분포가 고르지 않으면 이동 차이가 발생합니다.
- 해결 방법: 얼룩 제거제를 넣은 후 완전히 섞거나 얼룩 제거 후 방법을 사용하세요.
-
샘플 관련:
- 미소띠: 과부화(보통 500ng 이상)로 인해 발생합니다. PCR, 효소 분해 또는 마커 분석에는 3~5µL면 충분합니다.
- 번짐(꼬리 현상): 분해로 인해 발생할 수 있습니다. 장갑과 RNase/DNase가 없는 도구를 사용하여 샘플을 다루십시오. 특히 RNA의 경우 매우 중요합니다.
-
전기영동 관련:
- 고전압(150V 이상)은 번짐을 유발할 수 있습니다. 권장 전압: 110~130V.
- 또한 흐르는 완충액의 pH와 이온 강도를 확인하세요. 항상 새로 준비한 완충액을 사용하세요.
4) 샘플이 우물에 끼어 있나요?
잠재적 원인:
- DNA/RNA와 가교결합된 샘플 내의 단백질 또는 세포 파편
- 과부하
- 잘못된 전압 또는 버퍼 구성
5) 희미한 띠?
-
큰 조각 띠가 희미함: 큰 DNA 조각은 염색약과 덜 효율적으로 결합합니다.
해결책: 얼룩을 더 추가하고 세탁량을 줄이세요. -
작은 조각 띠가 희미함: 얼룩이 옮겨간 영향을 받았을 수 있습니다.
해결책: 염색 후 처리 방법을 고려해 보세요.
관련 제품 선택을 위한 지침
기존 PCR |
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| 사양 | 10167ES | 10102ES | 10103ES | 10108ES |
| 증폭 길이 | ≤10 -15 kb | ≤5kb | ≤5kb | ≤4kb |
| 연장 시간 | 1~10초/kb | 30초/kb | 30초/kb | 30초/kb |
| 제품 최종 구조 | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA |
| 어닐링 온도 | 60도 | 온도-(2~5)℃ | 온도-(2~5)℃ | 온도-(2~5)℃ |
| GC 호환성 범위 | 30-70% | 40~70% | 40~70% | 30-70% |
| 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 | 현재의 | 현재의 | 현재의 | 현재의 |
| 콜로니 PCR | 적합한 | 적합한 | 적합한 | 적합한 |
| 유전자 식별 | 적합한 | 적합한 | 적합한 | 적합한 |
| 멀티플렉스 PCR | 적합하지 않음 | 적합하지 않음 | 적합하지 않음 | 3-4 플렉스 PCR |
| 전기영동 지시약 | 보라색-빨간색 | 파란색 | 무색 | 파란색 |
| 핫 스타트 | 핫 스타트 | 핫 스타트가 아닙니다 | 핫 스타트가 아닙니다 | 핫 스타트 |
| 프리믹스/키트 | 프리믹스 | 프리믹스 | 프리믹스 | 프리믹스 |
직접 PCR |
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| 사양 | 10185ES | 10188ES | 10187ES | |
| 제품 유형 | 마우스 직접 증폭 | 혈액 직접 증폭 | 식물 직접 증폭 | |
| 증폭 길이 | ≤1kb | ≤8kb | ≤1kb | |
| 연장 시간 | 30초/kb | ≤2kb의 경우 3-5초/kb | 60초/kb | |
| ≤8kb의 경우 10s/kb | ||||
| 샘플 용해 시간 | 15분 | 0-3분 | 0-10분 | |
| 제품 최종 구조 | 블런트 엔드 | 블런트 엔드 | 블런트 엔드 | |
| 어닐링 온도 | 온도-(2~5) ℃ | 온도-(1~2) ℃ | 온도-(2~5) ℃ | |
| GC 호환성 범위 | 30-70% | 30-75% | 40-65% | |
| 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 | √ | √ | √ | |
| 유전자 식별 | √ | √ | √ | |
| 멀티플렉스 PCR | 3-4 플렉스 | |||
| 직접 샘플 증폭 | √ | √ | √ | |
| 전기영동 지시약 | 파란색 | 무색 | 파란색 | |
| 핫 스타트 | √ | √ | √ | |
| 프리믹스/키트 | 키트(믹스 포함) | 키트(믹스 + 버퍼 포함) | 키트(믹스 포함) | |
| 적합한 생물체 | 쥐, 쥐 | 사람, 쥐, 염소, 닭, 돼지 등 | 쌀, 옥수수, 담배, 유채, 밀, 콩 등 | |
| 적합한 조직/재료 | 꼬리, 귀, 발가락(근육 포함) 및 기타 기관 | EDTA, 헤파린, 시트르산 등이 함유된 신선한 혈액, 냉장(냉동) 혈액, 시판되는 건조 혈액 반점 | 어린 잎, 오래된 잎, 묘목, 어린 줄기 | |
| 샘플 입력 | 조직: 5-10mg; 꼬리: 1-5mm | 전혈: 0.5%-20%, 건조 혈흔: 1 mm² | 잎: 1-10mm, 씨앗: 1-3mm | |
고충실도 PCR |
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| 사양 | 10164ES | 10153ES | 10154ES | |
| 증폭 길이 | ≤10kb gDNA, ≤10kb cDNA, ≤16kb λDNA | ≤10kb gDNA, ≤10kb cDNA, ≤13kb λDNA | ≤10kb gDNA, ≤10kb cDNA, ≤13kb λDNA | |
| 연장 시간 | 5초/kb | 30초/kb | 30초/kb | |
| 충실도(Taq) | 83× | 83× | 83× | |
| 제품 최종 구조 | 블런트 엔드 | 블런트 엔드 | 블런트 엔드 | |
| 어닐링 온도 | 60 ℃ | 68 ℃ | 68 ℃ | |
| GC 호환성 범위 | 20~80% | 30-60% | 30-60% | |
| 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 | 결석한 | 결석한 | 결석한 | |
| 전기영동 지시약 | 파란색 | 무색 | 파란색 | |
| 단일 효소/프리믹스 | 프리믹스 | 단일 효소 | 프리믹스 | |
| 용인 | / | / | 혈액, 마우스 조직 용해물 | |
핵산 전기영동 |
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| 제품 카테고리 | 카탈로그 번호 | 제품명 | 애플리케이션 | |
| 아가로스 | 10208ES | 아가로스 | 일상적인 핵산 전기영동 | |
| 10221ES | 고분체 아가로스(PCR 등급) | 폴리아크릴아마이드 겔과 비슷한 20bp~800bp의 DNA 단편 분리에 적합 | ||
| 10226ES | 아가로스 정제(0.5g/정제) | 일상적인 아가로스 응용 분야에 편리함 | ||
| 핵산 염료 | 10202ES | YeaRed 핵산 겔 염색(물에서 10,000배) | 수용성이며 EB와 유사한 분광 특성을 가지고 있으며 300nm UV광에서 여기 가능합니다. | |
| DNA 마커 | 10510ES | 골드밴드 1kb DNA 래더 | 250-12000 bp(13개 밴드) | |
| 10515ES | 골드밴드 50bp DNA 래더 | 50-1000 bp(14개 밴드) | ||
| 10507ES | 골드밴드 100bp DNA 래더 | 100-1500bp(12개 밴드) | ||
| 10516ES | GoldBand 100 bp 플러스 DNA 래더 | 100-3000 bp(14개 밴드) | ||
| 10517ES | 골드밴드 200bp DNA 래더 | 200-5000 bp(12개 밴드) | ||
| 10518ES | 골드밴드 500bp DNA 래더 | 500-5000 bp(8개 밴드) | ||
| 10501ES | 골드밴드 DL2000 DNA 마커 | 100-2000 bp (6개 밴드) | ||
| 10504ES | 골드밴드 DL5000 DNA 마커 | 100-5000 bp (9개 밴드) | ||
| 10505ES | 골드밴드 DL10,000 DNA 마커 | 100-10000 bp (10개 밴드) | ||
| 10511ES | 골드밴드 풀스케일 DNA 사다리 | 100-12000 bp (20개 밴드) | ||
| 10512ES | 골드밴드 DL15000 DNA 마커 | 250-15000 bp(7개 밴드) |