実験手順
1.マトリゲル調製
1) 実験の前日に、マトリゲルを冷凍庫から取り出し、4℃の冷蔵庫で一晩解凍します。その間に、使用するすべての材料を予冷しておきます。
2)実験中はマトリゲルを氷の上に置いておきます。
3)血管新生スライドの滅菌包装を開けて、スライドを取り出します。
4)各ウェルにマトリゲル 10 μL を加え、マトリゲルが上のウェルに流れて残留物が残らないように、ピペットのチップがウェルの中央の真上にあることを確認します。
2.ゲル形成
1)まず、スライドを覆い、湿らせたペーパータオルを入れた 10 cm の培養皿を用意して、加湿チャンバーを作成します。
2)スライドを培養皿の中に入れ、蓋をします。
3)培養皿全体をCO2インキュベーターに入れ、ゲル形成まで約30分間静置します。その間に細胞懸濁液を調製します。
3.細胞播種
1)消化した細胞を使用して 2×10^5 細胞/ml の密度で細胞懸濁液を調製し、よく混合します。
2)マトリゲルが固まったスライドを回収します。
3)各ウェルに 50 μL の細胞懸濁液を加え、ピペットのチップが下のゲルに触れないように、上のウェルの上に垂直に保たれていることを確認します。
4)細胞培養培地を加え、蓋をして静置します。しばらくすると、すべての細胞がマトリゲルの表面に沈殿します。
4.画像取得
細胞の成長速度に応じて観察・撮影し、画像を保存します。
5.免疫蛍光染色（オプション）
1)ゲルや細胞ネットワークを乱さないように、ウェルから培地を慎重に除去します。カルセインを無血清培地で希釈し、最終濃度が6～8µg/mLになるようにします。
2)細胞が完全に浸るのに十分な染色液を加え、暗所で室温で 30 ～ 40 分間インキュベートします。
3) PBS で 3 回洗浄し、細胞が剥がれないように上部のウェルに PBS をゆっくりと加えます。
4) Ex=485 nmおよびEm=529 nmの波長を使用して蛍光を観察します。
6.結果の定量化
チューブの長さ、カバーエリア、ループ数、ノードを測定して記録し、統計分析を実行します。
注記
1)マトリゲルと接触するすべてのチップ、プレート、EP チューブは事前に冷却する必要があります。
2)マトリゲルを広げる際に気泡が入らないようにしてください。気泡があると観察が妨げられる可能性があります。
3)チューブ形成にさえ影響する可能性のある凝集を防ぐために、播種時に細胞が均一に分散されていることを確認します。
4)細胞を播種する際は、ゲルの平坦性を損なってイメージングに影響を与えないように、優しく扱ってください。
5) 細胞懸濁液の温度を維持します。温度が低いとゲルが溶け、接種後に細胞がチューブ内へ移動して分化することが難しくなります。