1. オルガノイドは単一の細胞タイプで構成されていますか、それとも多細胞構造ですか?
オルガノイドは、成体幹細胞または多能性幹細胞をin vitro 3D培養によって作製される3次元（3D）組織類似体です。単一の細胞種で構成されているわけではありません。オルガノイドは、前駆細胞としての性質を持つ幹細胞から発生し、増殖と分化を経て、生体内の対応する臓器の形態、構造、機能を模倣する多細胞構造へと自己組織化します。
2. オルガノイド培養のためのサンプルの供給源は何ですか?
- 成体幹細胞 (ASC)、多能性幹細胞 (PSC)、人工多能性幹細胞 (iPSC) などの幹細胞から得られるオルガノイド。
- 組織由来オルガノイドは、通常、腫瘍組織から作製される。
3. 新鮮組織がない場合でも、凍結保存した組織を 3D 培養に使用できますか?
はい、しかし凍結保存する組織のサイズは非常に重要です。さらに、一次凍結保存された組織や細胞の生存率は著しく低下し、その後の培養の成功率が大幅に低下します。
4. オルガノイドはどのように凍結保存され、解凍されるのでしょうか?
オルガノイドは、生存率と分化能が最適なパッセージ2～5（P2～P5）で凍結保存するのが最適です。解凍したオルガノイドは、標準的な細胞回復プロトコルに従ってください。
5. 培養オルガノイドのサイズは制御すべきでしょうか？大きい方が常に良いのでしょうか？
はい、サイズ管理は不可欠です。オルガノイドは血管や体液循環系を持たないため、理想的には直径500μm未満に維持する必要があります。より大きなオルガノイドでは、拡散が制限されるため、中心部の細胞は十分な酸素と栄養素を得られず、中心部での細胞死が増加します。
6. マトリゲル以外にオルガノイド培養に使用できる材料は何ですか?
代替の基質としては次のようなものがあります。
- 脱細胞外マトリックス（dECM）および派生タンパク質
- 合成ハイドロゲル;
- 組み換えタンパク質をベースにしたゲルを設計しました。
7. オルガノイドの指向的分化はどのように達成できるのでしょうか?
幹細胞由来オルガノイドの初期発生は、複数のシグナル伝達経路によって制御されています。in vitroでは、分化を誘導するために特定の成長因子やサイトカインを添加することで、これらの経路を模倣することができます。例えば、Y27632とアクチビンAは多能性幹細胞（PSC/iPSC）を胚体内胚葉（DE）へと分化誘導し、その後Wnt3a、FGF-4、ノギンを添加することで、さらに系統特異的な分化を誘導することができます。
8. 臨床サンプルを採取する際に汚染を避けるにはどうすればよいでしょうか?
- 可能な限り滅菌採取を行ってください。
- 二重抗生物質（例：ペニシリン/ストレプトマイシン）を含む PBS で組織を前処理します。外部環境に曝露された組織（例：胃、腸、膀胱の腫瘍）の場合は、3～5% の抗生物質を含む PBS に 5～10 分間浸します。その他の組織の場合は、1～2% の抗生物質を約 5 分間使用します。
- 細胞分離中に使用するすべての試薬に 1% 抗生物質と適切な初代細胞抗生物質を追加します。
9. 腫瘍組織の収集、保存、輸送に関する考慮事項は何ですか?
腫瘍を多く含む組織を可能な限り採取し、サンプルが空気に触れる時間を最小限に抑えることで汚染リスクを低減します。組織は直ちに専用の保存液を入れた滅菌チューブに移し、冷蔵（約4℃）下で速やかに検査室へ搬送してください（理想的には採取後2～4時間以内）。
10. 腫瘍病変由来のオルガノイドと隣接する正常組織には違いがありますか？腫瘍組織のサンプリングにはどのような要件がありますか？
はい、差異は存在します。腫瘍は本質的に不均一であり、異なる部位から採取したオルガノイドは形態学的および機能的にしばしば差異を示します。原発性腫瘍部位から採取したオルガノイドは、隣接する正常組織から採取したものと比較して、より不規則で浸潤性の高い構造を示す傾向があります。モデリングや薬剤スクリーニングにおけるばらつきを最小限に抑えるには、腫瘍から複数の生存領域を採取してください。
11. 患者由来オルガノイド (PDO) 薬剤感受性アッセイではどのような種類の薬剤をテストできますか?
PDO テストに適した抗がん剤の主なカテゴリは次のとおりです。
- 細胞傷害性化学療法薬（例：パクリタキセル、シスプラチン/カルボプラチン、5-FU）
- 標的療法（例：EGFR、HER2、VEGFRを標的とする阻害剤）
- 免疫療法、特に免疫チェックポイント阻害剤（例：PD-1/PD-L1 抗体）。
12. PDO 培養の成功率はどのくらいですか?
成功率は組織の由来によって若干異なりますが、一般的には63%から70%の範囲で、90%に達したという報告もあります。成功率は組織の生存率に大きく依存します。臨床的な取り扱い手順と体外培養期間の短縮により、成功率を向上させることができます。
13. 凍結組織はオルガノイド培養に使用できますか？
凍結保存は、生存率の大幅な低下を招くため、一般的には推奨されません。ただし、組織を-80℃で保存した場合、オルガノイド培養に最適な期間は6週間以内です。液体窒素で保存した組織はより長期間の保存が可能ですが、最良の結果を得るには6ヶ月以内に培養することをお勧めします。
14. 初代培養細胞の分離中に線維芽細胞が混入することがよくあります。どのように取り扱うべきでしょうか？
- 繰り返し前培養を行うことで線維芽細胞の弱い接着力を利用し、ほとんどの混入線維芽細胞を除去します。
- 市販の線維芽細胞除去キットを使用しますが、オルガノイド形成への影響は実験的に検証する必要があります。
15. 腫瘍オルガノイド培養にはどれくらいの腫瘍組織が必要ですか？生検材料で十分ですか？
外科的標本の場合、腫瘍組織は2～3粒分以上の大きさである必要があります。コア針生検の場合、少なくとも2～3個の生検コアが推奨されます。内視鏡生検の場合、少なくとも6個の組織片を採取する必要があります。
16. 最初の腫瘍組織が小さく、得られたオルガノイドが下流のアッセイに不十分な場合は、どうすればよいですか?
継代中に表現型の変動が生じる可能性があるため、大規模な増殖は推奨されません。文献では、継代を2～3世代（最大5世代）に制限することを推奨しています。5継代後も細胞数が不十分な場合は、アッセイボリュームを減らすために、384ウェルプレートやマイクロ流体デバイスなどの代替検出プラットフォームの使用を検討してください。
17. 腫瘍組織には正常細胞が含まれていますか？どうすれば除去できますか？
はい、腫瘍組織には少量の正常細胞が含まれている可能性があります。解剖の際には、正常組織を可能な限り避けてください。初代細胞分離後、磁気活性化細胞選別（MACS）または蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて腫瘍細胞を濃縮し、オルガノイド培養を行うことができます。少量の正常細胞は通常、オルガノイドモデリングに大きな影響を与えず、許容される可能性があります。
18. 腫瘍組織から抽出した原発細胞が赤色になることがあるのはなぜですか?
腫瘍は血管が発達しているため、赤血球（RBC）が残存していることがよくあります。少量のRBCはオルガノイド培養に影響を与えません。RBCの混入がひどい場合は、培養前に赤血球溶解バッファーを使用してください。
19. オルガノイド培養中に黒い粒子が現れます。どうすれば除去できますか？
黒い粒子は、おそらく破片または細胞片です。以下の2つの方法があります。
1. オルガノイドを単一細胞に分解し、培養培地で繰り返し洗浄して汚染物質を希釈します。
2. 滅菌メスを使用してオルガノイドを半分に切断し、1 mL シリンジを使用して内部を培養培地でゆっくりと洗い流します。
20. オルガノイドの継代数に制限はありますか？何回まで継代可能ですか？
継代数は細胞の種類によって異なります。ほとんどのオルガノイドはin vitroで最大10回（6ヶ月以上）まで継代可能です。培養培地の組成も重要な役割を果たします。馴化培地は、合成培地よりも長期間の増殖をサポートすることが多いからです。
21. 腫瘍細胞株（例：HepG2）を患者由来オルガノイド（PDO）に培養できますか？
いいえ。PDOは、異種組織から派生した複雑で自己組織化された3D構造です。単一の不死化細胞株から形成された3DスフェロイドはPDOとはみなされず、3Dスフェロイドまたは腫瘍スフェロイドと呼ばれるべきです。
22. オルガノイドの継代基準は何ですか?
継代はオルガノイドの発育状況に応じて異なります。通常、オルガノイドは直径100～200μmに達すると5～10日ごとに継代されます。成長が遅いオルガノイドでは、継代サイズに達するまでに数週間かかる場合があります。
23. 生存可能なオルガノイドを数えるにはどうすればいいですか?
カルセインAMを培養培地に添加し、最終濃度を0.2μmol/Lに調整します。37℃で60分間インキュベートします。PBSで優しく洗浄し、余分な色素を除去した後、新鮮な培地を加えます。励起波長490 nm、蛍光波長515 nmのフィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察します。生存オルガノイドは緑色で、明瞭に観察されます。直径20μmを超えるオルガノイドを数えます。
24. オルガノイドの生存率はどのように計算されますか?
生存率は次のように計算されます:
X = (N_live / N_total) × 100%
どこ：
X = オルガノイド生存率（％）
N_live = 生存可能なオルガノイドの数
N_total = オルガノイドの総数
25. オルガノイドの特性評価にはどのような方法が用いられますか?
基本的な特性評価には、光学顕微鏡検査とH&E染色による形態学的評価が含まれます。さらに、ウェスタンブロット、qRT-PCR、免疫蛍光法、フローサイトメトリーによる系統特異的バイオマーカーの検出などの検証も行われます。ゲノムシーケンシングは、元の組織に対する遺伝学的忠実度を評価することができます。機能アッセイ（例：胃オルガノイドにおける酸分泌、心臓オルガノイドにおける自発拍動）は、さらなる検証に役立ちます。
26. 正常細胞はオルガノイドを形成できますか？腫瘍オルガノイド培養中に正常オルガノイドを除去するにはどうすればよいでしょうか？
はい、正常上皮細胞もオルガノイドを形成できます。腫瘍オルガノイドを濃縮するには：
- H&E 形態学に基づいて顕微鏡下で手作業で摘み取ります。
- 腫瘍オルガノイドの成長を促進するために培養培地を変更します（例：選択的阻害剤を追加します）。
- オルガノイドを単一細胞に分離し、腫瘍細胞の濃縮のために FACS または MACS を実行します。
27. 薬剤感受性試験の前に PDO をマトリゲルから分離する必要がありますか?
いいえ。3D構造はin vivoでの反応を再現するために不可欠です。マトリゲルを除去すると構造の完全性が損なわれ、アッセイの精度が低下します。ほとんどの可溶性薬物はマトリゲルを通過します。ただし、免疫細胞の共培養や細胞毒性アッセイでは、マトリゲルの除去が必要になる場合があります。
28. PDO モデルは動物モデル (例: PDX) を完全に置き換えることができますか?
PDOはPDXモデルを部分的に代替することはできますが、完全に代替することはできません。動物モデルは、全身性薬物代謝、腫瘍微小環境相互作用、免疫浸潤、転移といった、in vitroでは完全にモデル化されていない複雑なプロセスをより適切に再現します。
29. PDO が異常な成長（例：周期の短縮、急速な増殖）を示す場合、その原因は何でしょうか？
外部要因:
- 増殖の速い細胞（例：線維芽細胞）による汚染。組織学的染色は、このような汚染の特定に役立ちます。
- 培養培地の組成の変更（例：成長促進因子の添加）。
内部要因:
- 遺伝子変異。シーケンシングを実施し、初期継代PDOと比較して確認します。
30. PDO における薬剤感受性を評価するにはどうすればよいでしょうか?
一般的な方法としては、CCK-8、ATPベースの生存率アッセイ、生死染色法などがあります。ATPレベルは代謝活性と生細胞数を反映するため、ATPアッセイが最も広く用いられています。IC50値（最大阻害濃度の半減期）は、解析ソフトウェアを用いて算出され、最も効果的な薬剤を特定します。
31. 薬剤感受性試験において、PDO と原発性腫瘍細胞の薬剤濃度範囲は同じですか?
いいえ。PDOの有効薬物濃度は、通常、2D初代培養細胞よりも高くなります。正式な薬物試験を行う前に、事前試験（用量設定試験）を実施することをお勧めします。
32. オルガノイドはどの段階で薬物試験に適していますか?
薬物試験は、遺伝的安定性と生物学的活性が最も高い 5 継代以内のオルガノイドを使用して実行するのが最適です。
33. オルガノイドの樹立が成功する条件は何ですか?
- 初期の形態学的変化：嚢胞状、出芽状、緻密、または緩い構造の形成。
- 免疫染色により確認された系統特異的バイオマーカーの発現は、元の組織内の分布と一致しています。
- ソース組織との遺伝的類似性を評価するために、配列決定によるさらなる検証。
34. オルガノイド培養と従来の 2D 細胞培養の主な違いは何ですか?
（１）培養方法：オルガノイドは構造を維持するために３Ｄスキャフォールド（例：マトリゲル）を必要とするが、２Ｄ培養は平面上で行われる。
（2）分化と複雑性：オルガノイドは体外で分化と自己組織化を起こすため、複数の成長因子を含む複雑な培地が必要になります。2D培養では通常、単一の細胞タイプとより単純な培地が使用されます。
（３）細胞源：オルガノイドは多能性上皮幹細胞に由来し、2D培養では不死化細胞株を含む様々な細胞タイプを使用することができる。
35. 3D 構造が標的組織に一致する本物のオルガノイドであるかどうかを確認するにはどうすればよいでしょうか?
マルチモーダル検証：H&E染色、免疫組織化学（IHC）、シングルセルRNAシーケンシング。腫瘍オルガノイドについては、既知のバイオマーカーの発現を評価する。以下は、NCCNガイドラインおよび文献に基づく代表的なマーカーである。
|
オルガノイド型 |
主要なバイオマーカー |
|
胃がん |
p53、CEACAM1、KRT20、E-カドヘリン、KRT7、Ki67 |
|
乳癌 |
ER-α、Her2、E-カドヘリン、KRT5、KRT14、PR、p63、サイトケラチン8、P-カドヘリン、KRT18、Ki67 |
|
鼻咽頭癌 |
Ki67、CD133、CD44 |
|
卵巣がん |
p53、Her2、PAX8、ER-α、PR、KRT7、E-カドヘリン、CD9、KRT19、EpCAM、ALDH1A1、CD44、サイトケラチン 8、KRT20、Ki67、HE4 |
|
大腸がん |
Ki67、MSH6、CDX2、KRT20、β-カテニン、P-CK、OLFM4 |
|
膵臓癌 |
Ki67、シナプトフィジン、KRT19、クロモグラニンA、MUC1 |
|
肺癌 |
p63、ナプシン A、KRT7、NCAM、シナプトフィジン |
|
肝臓がん |
Ki67、EpCAM、α-フェトプロテイン、GPC3、β-カテニン、KRT19 |
36. 私のオルガノイドの形態が文献に記載されているものと異なるのはなぜでしょうか?
バリエーションは以下から発生する可能性があります:
- 患者間の異質性と腫瘍のサブタイプ
- 成長因子の品質またはバッチの違い。
- 培養条件。
オルガノイドの同定には、HE染色、IHC染色、およびシークエンシングを用いて、元の組織と比較検討することをお勧めします。形態は研究室によって異なる場合があり、公開されている画像に厳密に限定されるべきではありません。
37. オルガノイド薬物アッセイでは、DMSOが溶媒として使用されます。その濃度は管理する必要がありますか？
はい。細胞毒性の影響を避けるため、最終的なDMSO濃度は通常0.5%（v/v）未満に保つ必要があります。
38. マトリゲルからオルガノイドを回収するにはどうすればいいですか?
推奨事項: 細胞や表面タンパク質を損傷せずにマトリゲルを穏やかに分離する市販のオルガノイド回復溶液を使用してください。
代替案: サンプルを氷上で冷やしてマトリゲルを液化させ、その後ピペットで静かに移してオルガノイドを放出します。
39. オルガノイドの回収中に、多くのオルガノイドがチューブ壁に付着してしまいます。回収効率を高めるにはどうすればよいですか？
回収後、遠心分離機でスイングバケット（水平）ローターを使用してください。遠心力をわずかに高め（例：約300 × g、約1000～1200 rpm）、オルガノイドを効率的にペレット化し、壁への付着を最小限に抑えます。