手順
1. 細胞採取
対数増殖期の細胞を80～90%の集密度で収集する 滅菌した遠心管に移します。
注：細胞は指数関数的に増殖している最中に採取する必要があります。細胞の状態は腫瘍形成効率に大きく影響します。細胞株の腫瘍形成能が低い場合は、支持的な細胞外マトリックスとしてマトリゲルを注入液に添加することができます。
2. 細胞の準備
細胞を1500 rpm、4℃で5分間遠心分離する。上清を除去し、1 mLのPBSに再懸濁する。細胞を2～3回洗浄する。
細胞をトリプシンで消化し、PBSまたは無血清培地で中和する。トリプシンを除去するために再度1～2回遠心分離し、PBSまたは培地に再懸濁して最終濃度1～5 × 10⁸細胞/mLとする。細胞懸濁液は氷上で保存する。
注：正確な細胞数を測定するために、細胞懸濁液を均一に混合してください。トリプシン処理後、細胞はできるだけ早く、できれば30分以内にヌードマウスの皮下に注入してください。注入回数が多い場合は、適切なタイミングで移植できるよう、複数のバッチに分割してください。
3. 細胞-マトリゲル混合物の調製
細胞懸濁液とマトリゲルを氷上で1:1の割合で混合し、最終濃度を1～5 × 10⁷細胞/mLとする。注射するまで氷上で保存する。
注入直前にピペットで細胞塊を分散させ、均一に分散させます。
注記： 細胞の代謝を抑え、早期ゲル化を防ぐために、混合物を冷たく保ちます。
4. 皮下注射
細胞-マトリゲル懸濁液100～200µLを、後腋窩や鼠径部などの血液供給が良好な部位に皮下注射します。
マウスが注射器を蹴らないように、親指と人差し指で肩と背中の上部の皮膚を優しくつまんでマウスを拘束します。マウスを直立させ、75%エタノールを浸した綿棒で注射部位の背部皮膚を2～3回消毒します。
5. 注入技術
筋肉を避け、針を皮下腔に優しく挿入します。細胞懸濁液をゆっくりと注入します。針を抜く前に数秒待ち、漏れを最小限に抑えます。
注：注射前にシリンジ内の空気を完全に抜いてください。針を皮下約1cmに挿入し、注射前に針を少し動かして、真皮や筋肉に刺入していないことを確認してください。針が自由に動く場合は、皮下層に刺入しています。
6. 注射後モニタリング
マウスをケージに戻し、生存率、腫瘍の成長、体重、食欲、全体的な健康状態を毎日監視します。
腫瘍形成は通常1週間から1ヶ月以内に起こります。実験計画に従って、腫瘍が1000 mm³を超える前にマウスを安楽死させ、写真を撮影してください。
注意:動物福祉上の理由から、腫瘍量が 1500 mm³ を超えることは避けてください。
7. 腫瘍採取
安楽死後、将来のRNA/タンパク質抽出のために腫瘍の一部を液体窒素で凍結します。
残りの組織をホルマリンで固定し、免疫組織化学分析または免疫蛍光分析を行います。
注意事項と注意事項
I. 細胞
1. 細胞株の特性
腫瘍形成能は細胞株によって異なります。腫瘍形成を評価するためのパイロットスタディを実施し、事前に関連文献を確認してください。
2. 細胞の状態
汚染を避けるため、滅菌技術を維持してください。マイコプラズマ感染は一般的であり、細胞の代謝、増殖、形態を変化させ、腫瘍の再現性に影響を与えます。
使用前にマイコプラズマ陰性であることを確認してください。対数増殖期の細胞のみを使用してください。注入前、および必要に応じて注入後にも細胞生存率を確認してください。
細胞の生存率を維持するため、細胞を氷上に保管してください。過剰なin vitro継代は避けてください（移植前の継代数は3～5回までに制限してください）。
II. 動物モデル
一般的な免疫不全マウス系統には、ヌードマウス、NOD-Scidマウス、NCGマウスなどがあります。腫瘍形成率は、免疫不全の程度とマウスの年齢によって異なります。パイロットスタディや既報に基づいて適切な動物モデルを選択することをお勧めします。年齢を重ねるにつれて免疫機能が活発になるため、高齢マウスの使用は避けてください。例えば、ヌードマウスでは、NK細胞の活性は8週齢以降に増加し始めます。4 ～6週齢のマウスは、 免疫システムが未熟なため、腫瘍の罹患率が高くなるため、一般的に好まれます。
III. 注射部位
一般的に使用される皮下注射部位は4つあります（下図参照）。細胞株の腫瘍形成能と実験の具体的な目的に基づいて注射部位を選択することをお勧めします。腋窩下領域（部位番号3）は、血液供給が豊富で右側へのアクセスが容易なため、一般的に最適と考えられています。増殖の速い腫瘍の種類の場合は、腫瘍の進行を遅らせるために、血管分布が比較的少ない下肢や背部などの代替部位を使用することもできます。あるいは、注射する細胞数を減らすことで、腫瘍の増殖速度を抑制できる場合もあります。
IV. 細胞投与量
最適な細胞投与量は、細胞株、マウスの系統、および注入部位によって異なります。腫瘍形成に最適な細胞濃度を決定するために、異なる投与量勾配を用いたパイロット試験を実施することが推奨されます。
さらに、細胞の種類によっては補助因子が必要になる場合があります。ほとんどの固形腫瘍細胞株では、細胞とマトリゲルを1:1の比率で混合するだけで十分です。卵巣がんモデルでは、エストロゲン補充が一般的に必要となり、通常は細胞移植後に別途注射で投与します。
V. 動物の飼育
マウスは輸送中にストレス反応を起こし、様々な病態生理学的変化を引き起こす可能性があり、実験結果にばらつきや誤差が生じる可能性があります。そのため、到着後すぐに実験に使用しないでください。実験を開始する前に、1～2週間の馴化期間を設けることを強くお勧めします。
高度に管理された飼育環境を維持してください。免疫不全マウスはSPF（特定病原体フリー）バリア施設で飼育し、交差汚染や感染を防ぐため、免疫能のあるマウスとは別の部屋で飼育する必要があります。
ヌードマウスは、環境中の弱い抗原に慢性的に曝露されると、NK細胞やその他の残存免疫細胞の活性が徐々に高まります。これにより、腫瘍細胞に対する非特異的免疫応答が強化され、腫瘍の生着率が低下する可能性があります。
NCGマウスおよびその関連系統は重度の免疫不全を有し、病原体に対する感受性が非常に高い。そのため、感染リスクを最小限に抑えるため、飼育環境は清潔に保ち、徹底した消毒を行う必要がある。
よくある質問:
通常のマウスではなくヌードマウスを使用するのはなぜですか?
ヌードマウスは胸腺を欠き、免疫系が著しく低下しています。そのため、ヌードマウスは異種移植に対して耐性があり、腫瘍の移植に最適です。一方、通常のマウスは免疫系が健全であるため、移植された腫瘍細胞に対する免疫拒絶反応が引き起こされ、腫瘍形成が阻害される可能性があります。
プロトコルを正しく守ったにもかかわらず、なぜ腫瘍が形成されなかったのでしょうか?
考えられる理由は次のとおりです:
- 細胞生存率が低い、または細胞株の腫瘍形成能が低い。
- 細胞株の移植を改善するには、マトリゲルの追加や接種量の増加が必要になる場合があります。
- 宿主マウスは免疫学的に成熟しているか、免疫不全が不十分な場合があり、免疫拒絶反応を引き起こす可能性があります。より重度の免疫不全マウスの使用を検討してください。
- 腫瘍の発達には時間がかかります。目に見える結節は1週間後に現れる場合もありますが、固形腫瘍の場合は1～2か月かかる場合があります。継続的な観察が必要です。
腫瘍が最初は大きくなってから、小さくなったり消えたりしたのはなぜですか?
これは、宿主による炎症反応または腫瘍細胞の免疫除去に起因する可能性があります。腫瘍が退縮し、再び増殖しない場合は、より高度な免疫不全を有するマウスの使用を検討してください。
同じグループ内の腫瘍間でサイズにばらつきがあるのはなぜですか?
腫瘍の成長は次のような要因によって影響を受ける可能性があります:
- マウス間の生物学的変動（例：年齢、体重、免疫状態）。
- 細胞懸濁液の量、濃度、または注入技術の違い。
- 部位の選択またはマトリゲルの使用における不一致。
エンドポイント分析に適した腫瘍サイズはどれくらいですか?
動物福祉規制によれば、腫瘍量はマウスの体重の10%を超えてはならず、どの寸法でも15 mmを超えてはなりません。
バイオマーカーの探索または短期研究の場合：目標腫瘍体積は 150～250 mm³ です。
長期的な薬効研究の場合：50～150 mm³が推奨されます。
不規則な形状の腫瘍を正確に測定するにはどうすればよいでしょうか?
動物の腫瘍の進行と全体的な健康状態を毎日監視します。
皮下腫瘍はノギスを使って測定できます。
内部腫瘍は、生体内蛍光イメージングまたは死後解剖によって評価できます。
体積の推定には、次の式を使用します:腫瘍体積 = (長さ × 幅²) / 2 。
成功率を高めるために、同じマウスに複数の腫瘍を誘発することはできますか?
いいえ。マウス1匹につき1箇所のみの注射が可能です。同一宿主における複数の腫瘍は互いに干渉し合い、解釈を複雑にする可能性があります。
腫瘍の成長中にマウスに壊死や潰瘍が生じた場合はどうなるでしょうか?
これは感染または過度の腫瘍負荷を示している可能性があります。
適切な治療（抗生物質など）を開始します。
潰瘍/壊死が1.5cmを超える場合、または治癒せずに48〜72時間続く場合は、人道的な安楽死を考慮する必要があります。
腫瘍の研究が完了した後、マウスはどのように扱われるべきでしょうか?
動物福祉に関する施設のガイドラインに従ってください。動物に以下の症状が見られる場合は、安楽死させる必要があります。
- 持続的な体重減少
- 重度の下痢または異常な排泄
- 腫瘍の潰瘍、壊死、または感染
- 腫瘍の急速な成長が動物の健康を損なう
腫瘍の転移をどのように評価するのでしょうか?
- 肉眼的剖検: 肝臓、腎臓、またはその他の臓器に目に見える転移病変が認められる。
- 生体内イメージング: 腫瘍細胞が標識されている場合 (例: ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質)、光学イメージング システムを使用して転移を監視できます。
- 小動物 MRI : 肝臓や肺などの臓器の転移を正確に検出できます。