なぜ融解曲線が奇妙に見えるのでしょうか?

qPCRにおける異常な融解曲線のトラブルシューティング

qPCR実験において、融解曲線は産物の特異性とデータの正確性を確保するために不可欠です。異常な融解曲線は、様々な潜在的な問題を示唆する可能性があります。これらの不規則性は何を示しているのでしょうか？データの解釈にどのような影響を与えるのでしょうか？このガイドでは、異常な融解曲線の一般的な原因を探り、クリーンで信頼性の高い結果を得るための実用的な解決策を紹介します。

1.単一のピークだが鋭くない

• 考えられる原因:

試薬の組成または機器の感度に関連します。

高感度機器では、より広いピークが生成される場合があります (赤い曲線を参照)。

• 許容範囲:

上昇から下降までの温度範囲が7°C以下の場合、結果は使用可能です。

• その他の可能性:

同様のサイズのマイナーな非特定製品。

高濃度アガロースゲル電気泳動（例：3％）で確認します。

2.単一ピークだが、Tm < 80°C

• 考えられる原因:

プライマーダイマーのみ、真の生成物なし →プライマーを再設計します。

産物が100 bp 未満の場合、 Tm 値が低くなることが予想されます。

3.ダブルピーク、マイナーピーク < 80°C

• 考えられる原因:

プライマーダイマー→プライマー濃度を下げるか、再設計します。

短い非特異的産物→アニーリング温度を上げ、温度勾配を用いて最適化します。一般的に、アニーリング温度は63℃を超えないようにしてください。また、テンプレート濃度を上げることも検討してください。

4. ダブルピーク、マイナーピーク > 80°C

• 考えられる原因:

非特異的増幅

• 解決：

焼鈍温度を上げる

ゲノムDNA汚染の除去

5. 不規則なピークまたはノイズの多いピーク

• 考えられる原因:

汚染されたテンプレート→テンプレートの品質を確認し、必要に応じて新しいテンプレートを準備します。

機器が校正されていない→定期的なメンテナンスを行ってください。

互換性のない消耗品→機器の互換性のある消耗品の要件を確認し、光学的透明性が良好なものを選択してください。

6. 同じ製品でも試薬によってTmが異なる

• 考えられる原因:

溶液中のイオン強度、pH、緩衝液成分はすべて、DNAの融解温度（Tm）に影響を与える可能性があります。緩衝液環境はDNA分子の電荷状態と安定性に影響を与え、二本鎖DNAの融解挙動に変化をもたらします。例えば、イオン強度が高く酸性条件では融解温度が低下する傾向があり、アルカリ性条件では融解温度が上昇する可能性があります。そのため、試薬間の変性剤の組成や濃度の違いがTm値の変動を引き起こす可能性があります。

7. 融解曲線が検出されない

• 考えられる原因:

qPCRセットアップで融解曲線の取得が無効になっている可能性があります。融解ステップ中に蛍光シグナルの取得が有効になっていることを確認してください。

• ヒント：

ほとんどの機器では、 「カメラ」アイコンを選択すると蛍光信号の収集が開始されます。（Roche 機器の場合は、融解曲線設定の最後の 95 °C ステップで、取得モードを「なし」ではなく「連続」に設定してください。）

8.カーブ開始時のベースラインドリフト

• 考えられる原因: ROX 濃度が計測器と一致しません。
• 解決策: ROX 補正を無効にして、曲線を再度確認します。

9. 融解曲線が遅れたり不完全であるように見える

• 考えられる原因:メルト プログラムの最終温度がアンプリコンの Tm に達しませんでした。
• 解決策:ターゲットのGC 含有量が高い場合、またはフラグメント長が長い場合(Tm が 90°C 付近)、今後の実行で融解曲線ステップの最終温度設定を上げます。

10. 曲線の始まりの窪みまたは谷

• 考えられる原因:変性添加剤のレベルが高いと、アニーリング/伸長が抑制される可能性があります。
• 解決策：蛍光収集の初期段階（60℃、1分）では、一部の鎖がまだアニーリング中であるため、SYBR Greenシグナルが増加する可能性があります。完全なアニーリング後、蛍光はピークに達し、温度と酸性度が上昇するにつれてシグナル強度が低下し、曲線にディップが生じます。
• 注意:この効果は無害であり、結果に影響を与えません。

11.カーブ開始時の緩やかな傾斜

• 考えられる原因:

融解曲線は、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変化を反映しています。曲線の初期段階における変動は、蛍光の減少速度の不均一性によるものです。低温では蛍光シグナルは大きく低下しません。これは、DNAの変性がまだ始まっていないことを示している可能性があります。むしろ、シグナルのわずかな減少は、温度によって引き起こされる溶液pHの変化によって引き起こされている可能性があります。曲線の後半部分は、DNAの融解に伴う通常の蛍光減少を表しています。

• 注:これも最終結果には影響しません。

12. 同じプライマーペアでも、異なるサンプルウェル間でTm値が異なり、1～2℃の差があるものの、すべて狭い単一のピークを示す。

• 考えられる原因:

同じ遺伝子であっても、異なるサンプル間、特に異なる種間では、個々の塩基配列にわずかな違いが見られることがあります。Tm値は塩基組成の影響を受けるため、わずかな違いが融解温度のわずかな違いにつながる可能性があります。

•  注意：曲線が狭い単一ピークであり、Tm差が2℃以内であれば、結果は許容可能です。

13. 同じプライマーペアは以前は二重ピークを示さなかった（左パネル）が、テンプレート/試薬を変更した後に二重ピークが現れた（右パネル）

• 考えられる原因:

Tm <80°C の以前の単一ピークは、プライマーダイマーのみが増幅された (実際の生成物がない) ことを示唆しています。
テンプレートまたは試薬を変更した後に二重ピークが現れる場合は、初期のプライマー設計に問題があることを示しています。

• 注：プライマーの再設計を検討してください。

こうした融解曲線の不規則性を理解し、対処することで、qPCR結果の信頼性を大幅に向上させることができます。このガイドが、効果的なトラブルシューティングとワークフローの最適化に役立ち、より優れた一貫性のあるデータが得られることを願っています。