完璧な増幅曲線は予測可能なパターンに従いますが、異常な曲線は様々な奇妙な形で現れることがあります。特にABI機器でよく見られる問題の一つは、急激な上昇スパイクを伴う曲線です。その原因は？ ROXの選択が不適切であることです。では、 ROXとは何か、何をするのか、なぜこのような曲線の不規則性を引き起こすのか、そしてどうすれば修正できるのか、詳しく見ていきましょう。
ROXとは何ですか?
ROX™色素は、1990年代にApplied Biosystems社が開発した、リアルタイムPCR（qPCR）で使用されるレポーター色素の蛍光を阻害しない、独立した不活性色素です。qPCR実験中は、ピペッティングエラー、蒸発、結露、気泡などの要因によって蛍光シグナルが歪められ、結果に影響を及ぼす可能性があります。ROX ™は、蒸発、ピペッティングの不正確さ、液滴の存在などの問題を診断することで役立ちます。また、気泡によって引き起こされる異常なシグナルを正常化しますが、データ品質の低下やピペッティングエラーを修正することはできません。
図1. ROX™色素ノーマライゼーションなしのBio-Rad CFX384™とLife Technologies ViiA™7システムにおけるqPCR増幅のダイナミックレンジ比較
図2. Life TechnologiesViiA™ 7システムのダイナミックレンジ（Rox™色素標準化）
- ROX補正前：STD=0.028
- ROX補正後：STD=0.01
一部の機器では ROX 補正が必要なのに、他の機器では不要なのはなぜですか?
すべては機器の光学系に依存します。例えば、 Bio-Radの機器は均一な光源を使用し、すべてのウェルを均一に照射することで、ウェル間の光路差をなくします。この場合、 SYBR GreenシグナルはPCR産物の蛍光を直接反映します（図A参照）。一方、 ABIの機器では、ウェルごとに光源が異なるため光路差が生じるため、通常はROX補正が必要です。ROX正規化はこれらの変動を調整し、正確なRn値を提供します（図B参照）。
高ROX vs. 低ROX
高ROXを必要とする機器は青色光源を使用しますが、この光源はSYBR Greenを強く励起しますが、 ROXを弱く励起します。つまり、適切な補正にはより高いROX濃度が必要です。一方、低ROX機器は青色と白色の混合光源を使用します。青色光はSYBR Greenを励起し、白色光はROXを励起するため、より低いROX濃度でも効果的に機能します。
間違った ROX を選択した場合はどうなりますか?
実験をすでに実行していて異常なデータに気付いたとしても、慌てる必要はありません。プレートセットアップでROXを「なし」に切り替え、データを再解析するだけで、正常な増幅曲線が得られるはずです。実験前に不一致に気付いた場合（例えば、 qPCRミックスが機器に適合していないなど）、試薬サプライヤーのテクニカルサポートに連絡して交換についてお問い合わせください。さらに、最新のqPCR試薬には「ユニバーサルROX 」が含まれており、ほとんどの機器モデルに適応するように設計されているため、複数の機器を保有するラボの作業が簡素化されます。